慢性丙型肝炎患者microRNA122水平与肝组织炎症坏死程度的关系

程文婷 孔德华

慢性丙型肝炎(CHC)是我国患病率较高的一种肝脏疾病，主要因HCV感染所致。研究表明在急性感染者中，约55%～85%的患者进展成慢性，而慢性丙型肝炎危害性非常大，若未能及时治疗，则可进展为肝细胞性肝癌、肝硬化，对患者生命构成威胁[1]。研究发现多种炎症细胞因子参与了CHC进展过程，如白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)等，炎症因子释放增加会导致机体出现炎症反应，引起肝脏损害[2]。近年来，研究指出microRNAs参与了肝病病理过程，它对细胞凋亡、增殖有调节作用，而MicroRNA-122是肝脏特异性RNA，对维持肝脏功能运行有重要意义[3]。本次研究为了进一步了解CHC的病理特征，纳入100例患者为研究对象，分析CHC患者microRNA122水平与肝组织炎症坏死程度的关系，现报告如下。

资料与方法

一、纳入与排除标准

纳入标准：(1)符合慢性丙型肝炎抗病毒治疗专家委员会提出的《慢性丙型肝炎抗病毒治疗专家共识》中的诊断标准[4]，临床诊断明确；(2)年龄≥18岁；(3)入院前3个月内无抗病毒、免疫抑制治疗史；(4)临床病例资料完整；(5)精神状态、认知正常；(6)知情同意。排除标准：(1)肾、肺、心、脑等重要器官损害；(2)癌症病史；(3)肝脏衰竭；(4)合并肝脂肪变、肝血管瘤等其他肝病；(5)慢性乙型肝炎、甲型肝炎。

二、一般资料

纳入我院2014年3月～2017年3月收治的CHC患者100例作为病例组，选取同期于我院体检的100例体检者作为对照组。病例组男56例，女44例，年龄23～75岁，平均(49.42±10.83)岁；体质指数18～26 kg/m2，平均(22.53±2.06)kg/m2；HCV基因型：1型84例，2/3型12例，6型4例；感染途径：输血感染26例，性传播感染49例，吸毒感染18例，不明原因7例。对照组男53例，女47例，年龄20～78岁，平均(51.69±12.32)岁；体质指数18～26 kg/m2，平均(22.34±2.11)kg/m2。两组性别、年龄、体质指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。

三、检测方法

两组受检者均于入院当日留取5 mL血清样本，经实时荧光定量PCR法测定microRNA122在血清中的表达水平：(1)组织制片染色：石蜡包埋制片→切片→脱蜡→HE染色→Masson染色。①HE染色过程：切片、脱蜡、蒸馏水，苏木素染色(约5～10 min)，利用水冲洗2次，伊红染色3 min，利用水冲洗2次，经数脂封片、固定。②Masson染色：切片、脱蜡、蒸馏水，苏木素染色(约5～10 min)，流水蓝化，水洗，酸性品红液中染(6～8 min)，水洗，经浓度为1%的磷钼酸中染(2～3 min)，加苯胺蓝液，反应5 min，冲洗，烘干，树脂封片、固定。(2)提取血清microRNA：①取200 μL样本，加变性溶液混匀；②取氯仿300 μL混匀；③离心5 min，分离血清；④加无水乙醇混匀；⑤弃废液；⑥加Wash Solution，离心15 s；⑦弃废液；⑧重复上述步骤，空甩离心柱；⑨加DEPC水，离心30 s；⑩定量检测RNA。(3)PCR反应条件：95 ℃ 10 min，55 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min，(95 ℃ 15 s、60 ℃ 4 min，12个循环)，99.9 ℃，10 min。

四、观察指标

比较病例组、对照组患者microRNA122在血清中的表达水平，并按照肝组织炎症活动度分级标准(G)对病例组患者进行炎症程度分级，以≤G2级为轻度炎症组，>G2级为中重度炎症组，比较两组血清microRNA122表达水平。炎症程度分级标准[5]：采用G0～G4等级进行评估，无炎症活动为G0级，肝门区可见轻度炎症为G1级，轻微碎屑样坏死为G2级，中度碎屑样坏死为G3级，重度碎屑样坏死为G4级，分别赋0、1、2、3、4分，分值越高表明炎症坏死程度越重。

五、统计学方法

结 果

一、病例组、对照组的血清microRNA122表达水平比较

病例组血清microRNA122表达水平为(4.728～5.525)lg 拷贝数/μL，平均(5.153±0.213)lg 拷贝数/μL。对照组为(3.723～4.316)lg 拷贝数/μL，平均(4.009±0.242)lg 拷贝数/μL。病例组血清microRNA122表达水平高于对照组，差异有统计学意义(t=35.485，P=0.000)。

二、轻度炎症组、中重度炎症组的血清microRNA122表达水平比较

通过对患者的肝组织炎症坏死程度进行分级，提示轻度炎症组48例(48.00%)，中重度炎症组52例(52.00%)。轻度炎症组血清microRNA122表达水平为(4.728～5.164)lg 拷贝数/μL，平均(4.893±0.021)lg 拷贝数/μL。中重度炎症组为(5.156～5.525)lg 拷贝数/μL，平均(5.242±0.032)lg 拷贝数/μL。轻度炎症组的血清microRNA122表达水平低于中重度炎症组，差异有统计学意义(t=91.181，P=0.000)。

三、血清microRNA122对CHC中重度炎症坏死的预测价值分析

血清microRNA122表达水平预测CHC中重度炎症坏死的曲线下面积为0.662(标准误=0.054，P=0.005，95%CI=0.556～0.768)，最佳截断值为4.920 lg 拷贝数/μL，敏感度为0.596，特异度为0.646，ROC曲线图见图1。

图1 血清microRNA122预测CHC中重度炎症坏死的ROC曲线图

四、CHC患者血清microRNA122表达与肝组织炎症坏死评分的相关性

CHC患者肝组织炎症坏死评分为(2.74±1.25)分，血清microRNA122表达水平为(5.153±0.213)lg 拷贝数/μL。经Pearson相关性分析提示，血清microRNA122表达水平与肝组织炎症坏死评分呈正相关(r=0.571，P=0.000)，二者线性相关图见图2。

图2 CHC患者血清microRNA122表达与肝组织炎症坏死评分线性相关图

讨 论

我国HCV感染率非常高，约50%的患者经治疗后，预后良好，但仍有部分病例效果欠佳，其抗病毒治疗疗效可能与免疫病、肝纤维化、胰岛素抵抗、肥胖等因素相关[6]。近年来，有研究指出microRNA122对肝脏特异性微小RNA存在调节作用，miR-122内含核苷酸总数为85个，当其被灭活后，HCV复制能力下降，提示miR-122对HCV复制有促进作用[7]。另有研究证实microRNA-122与HCV复制呈正相关[8]。然而，既往研究中主要集中于分析microRNA-122与HCV复制的关系，缺乏对microRNA-122与肝组织炎症关系的探讨。肝脏炎症坏死程度是反映患者病情的重要指标，及时了解患者机体炎症情况，有利于进一步评估其疾病严重度，为疾病治疗提供依据。

本次研究着重于分析microRNA-122与CHC患者肝组织炎症坏死程度的关系，结果显示与体检者相比，CHC患者的血清microRNA122表达水平显著增高，提示这类患者病情进展可能与microRNA122在血清内的表达水平相关。研究表明与血清ALT相比，microRNA122对急性肝损伤的评估价值更高，能有效评价肝脏损害程度，即便患者血清ALT在正常范围，其microRNA122在血清中的表达明显增高，进一步证实血清microRNA122表达量对肝脏损害具有较高诊断价值[9]，为本研究开展提供了理论依据。

CHC进展过程与机体炎症存在密不可分的关系，当发生HCV感染后，可导致机体免疫失衡，即Th1/Th2失衡，不利于清除HCV，且会抑制免疫应答反应，从而致使患者机体处于持续感染状态，进一步损害肝细胞功能。本研究根据CHC患者肝组织炎症坏死程度将其分为轻度炎症组、中重度炎症组，结果提示中重度炎症组的血清microRNA122表达水平高于轻度炎症组，提示血清microRNA122表达量增高可能与炎症程度相关。研究表明当出现药物性肝损伤、病毒性肝炎等肝损害时，microRNA122在外周血中的表达水平增高，且随着炎症程度加深，其表达量越高[10]，与本研究结论基本符合。本研究通过绘制ROC曲线，证实血清microRNA122表达水平对CHC患者肝组织炎症坏死程度具有一定预测价值，且血清microRNA122表达与肝组织炎症坏死评分呈正相关，这可能的原因在于microRNA122参与了脂肪酸氧化反应过程，从而促进炎症进展。

综上，本研究证实与体检者相比，CHC患者的血清microRNA122表达水平增高，且血清microRNA122表达量与肝组织炎症坏死程度呈正相关，研究的创新之处在于明确了轻度炎症、中重度炎症的最佳截断值，能为临床治疗提供依据。此外，本次研究因受病例研究经费、研究时间等因素限制，导致纳入样本量少，未来还需扩大样本量，对此进行多中心、大样本量的探讨。