附子水溶性生物碱含量测定与道地性相关分析

罗春梅，夏燕莉，黄志芳，汤依娜，刘云华，刘玉红，陈 燕，易进海*

1四川省中医药科学院 中药材品质及创新中药研究四川省重点实验室，成都 610041；2成都大学 药学与生物工程学院，成都 610106

附子为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品[1]，为临床常用有毒中药，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效，被历代医家称为“最难用亦最有用的药材”[2,3]。附子主要种植在我国西南地区，主产区分布在四川江油、四川布拖、陕西汉中及云南等地，其中江油为公认的附子传统道地产区，质量上乘，有长达1 300余年栽培历史，具有成熟而独特的栽培和加工技术[4]。为了满足市场需求，其他非道地产区附子运往江油加工后作为江油附片混淆销售，使江油附子的道地品牌和品质受到严重影响。目前，附子道地性的形成机制尚不清楚，市场上附片品种较多，质量参差不齐。因此，寻找区分道地产区附子与非道地产区附子的特征性差异成分，对附子及附片的质量进行有效控制成为亟待解决的问题。

现代药理学研究表明，水溶性生物碱为附子的重要活性成分，具有强心[5-8]、抗心律失常、抗炎镇痛、降压等作用[9-12]。绝大部分水溶性生物碱不含紫外吸收基团，不能采用常规的HPLC-UV法进行检测[13]。张定堃等[14]采用UPLC-Q-TOF-MS法分析出尼奥灵、宋果灵等7种可能为区分不同产地附子的差异成分，林俊芝等[15]也采用UPLC-Q-TOF/MS法证实尼奥林、附子灵等在江油附子中含量较高。本课题组预实验结果证明，江油附子中尼奥灵含量的确明显高于其他产区，故收集江油、陕西、布拖、云南四个产区42批泥附子，以及9批由江油附子炮制加工的生附片、蒸附片、炒附片，采用HPLC-ELSD法测定尼奥灵、附子灵及宋果灵3种主要水溶性生物碱的含量，进行水溶性生物碱含量与道地性的相关分析，为附子的道地性鉴别及附片的质量控制提供新方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent 1260 Infinity 蒸发光散射检测器(美国Agilent公司)，MS205DU型十万分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司)，Milli-Q Integral 3型超纯水机(美国Millipore公司)，KQ-300超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，冷冻干燥机，ST16R型台式冷冻离心机(Thermo Scientific公司)。

1.2 材料

附子灵(批号MUST-16032804)、尼奥灵(批号MUST-16052503)、宋果灵(批号MUST-16032515)，质量分数均≥98%(成都曼思特生物科技有限公司)，色谱纯乙腈、甲醇(美国Fisher公司)，色谱纯三乙胺(成都市科龙化工试剂厂)，其余试剂均为分析纯。42批鲜附子采自四川江油、陕西汉中、四川布拖、云南，编号分别为JY 1～JY 10，SX 1～SX 8，BT 1～BT 13，YN 1～YN 11，江油附子炮制加工的生附片、蒸附片、炒附片购于四川江油中坝附子科技发展有限公司，编号分别为SFP 1～SFP 3，ZFP 1～ZFP 3，CFP 1～CFP3，由成都大学夏燕莉教授鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根，样品信息来源见表1，不同产区附子图片见图1。

图1 江油(A)、陕西(B)、布拖(C)、云南(D)产区泥附子外观性状Fig.1 Appearance of crude Fuzi from Jiangyou (A),Shaanxi (B),Butuo (C) and Yunnan (D)

表1 不同产区附子及附片信息

2 方法与结果

2.1 混合对照品储备液的制备

取各对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶液制成每1 mL含附子灵0.3 mg，尼奥灵0.35 mg，宋果灵0.15 mg的混合对照品储备溶液。

2.2 供试品溶液的制备

42批鲜附子洗净泥沙，晾干后切成薄片冷冻干燥，粉碎(过60目筛)备用。各批次附片粉碎，过60目筛备用。取上述附子和附片粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.05 mol/L盐酸溶液25 mL，摇匀，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，摇匀，于8 000 rpm离心6 min，取上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件及系统适应性实验

色谱柱：Agilent Extend C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%(体积分数)三乙胺(B)，梯度洗脱(0～8 min，10%～20% A；8～15 min，20%～25% A；15～25 min，25%～25% A；25～30 min，25%～28% A；30～31 min，28%～50% A；31～38 min，50%～55% A；38～48 min，55%～90% A)；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测器：蒸发光散射检测器，以氮气为载气，蒸发温度50 ℃，载气流速1.2 L/min，增益为1；进样量40～80 μL。在上述色谱条件下，混合对照品、附子及附片样品的HPLC图见图2。

图2 对照品(A)、江油附子(B)、陕西附子(C)、布拖附子(D)、云南附子(E)、生附片(F)、炒附片(G)及蒸附片(H)的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A),crude Fuzi of Jiangyou(B),Shaanxi (C),Butuo(D) and Yunnan(E),Sheng Fupian(F),Chao Fupian(G) and Zheng Fupian(H)注：1.附子灵；2.尼奥灵；3.宋果灵。Note:1.fuziline;2.neoline;3.songorine.

2.4 线性与范围、检测限与定量限

分别精密吸取“2.1”项下混合对照品储备液0.5、1、3、6、8、10 mL，分别置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。吸取上述混合对照品溶液20 μL，按“2.3”项下色谱条件测定色谱峰面积。以峰面积的对数值为纵坐标(Y)，对照品进样量的对数值为横坐标(X)，进行线性回归分析，计算回归方程和相关系数；将混合对照品溶液逐级稀释后进样测定，以色谱图中信噪比S/N为3∶1和S/N为10∶1确定检测限和定量限，结果见表2。

表2 3种生物碱的线性与范围、检测限与定量限

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(ZFP1)80 μL，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示，附子灵、尼奥灵、宋果灵的RSD分别为2.47%、2.84%、1.22%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液(ZFP1)，室温下放置，分别于0、2、4、8、12、24 h进样80 μL，按“2.3”项下色谱条件分析，附子灵、尼奥灵、宋果灵峰面积的RSD分别为2.11%、3.56%、3.85%，表明供试品溶液室温放置24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批样品(ZFP1)，精密称取6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分析，进样80 μL，测得附子灵、尼奥灵、宋果灵含量的平均值(n=6)分别为0.308 6、0.832 5、0.252 9 mg/g，RSD分别为0.71%、2.54%、1.24%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品(ZFP1)6份，每份约0.5 g，精密加入混合对照品溶液适量，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样80 μL，照“2.3”项下的色谱条件进行含量测定，计算3种生物碱的平均回收率及RSD，结果见表3。

表3 加样回收试验结果( n = 6)

2.9 样品含量测定

各产区附子及附片按“2.2”项下方法制备供试品溶液，平行2份，照“2.3”项下的色谱条件进行测定，计算3种水溶性生物碱的含量，结果见表4～8。四个产区附子及附片中3种生物碱的均值分布见图3。从3种生物碱的总体分布趋势来看(图3A)，江油与陕西产区分布类似，而布拖则与云南产区相似。表4～7显示四个产区附子中3种生物碱的分布明显不同，其中附子灵、尼奥灵的含量差异较大，含量分别在230.2～2 407.2 μg/g，0～1 834.5 μg/g之间，尼奥灵在江油产区中含量最高，均值为1 352.6 μg/g，约为云南、布拖产区均值的3.5倍，明显高于其他产区；而附子灵在云南产区中含量最高，均值为1 317.0 μg/g，约为江油、陕西产区均值的3.0倍。由此可见，尼奥灵可能为区分江油附子与其他非道地产区附子的特征性差异成分，其含量均大于880 μg/g。

生附片和炒附片中尼奥灵含量均大于1 500 μg/g，与江油泥附子中尼奥灵的含量相当，而蒸附片中尼奥灵含量约为生附片的一半，可能是由于附片蒸制过程中，尼奥灵随水蒸汽冷凝而丢失。上述结果证明，江油附子炮制加工成附片，尼奥灵也是3种水溶性生物碱中含量最高的成分，其整体概貌与江油附子相似(图3B)，且3种附片炮制品内部尼奥灵含量差异不大，质量稳定可控。因此，尼奥灵可作为区分江油生附片、炒附片、蒸附片与其他非道地产区附片的质量评价指标。

表4 江油附子中3种生物碱的含量 (μg/g,n=2)

表5 陕西附子中3种生物碱的含量 (μg/g,n=2)

表6 布拖附子中3种生物碱的含量 (μg/g,n=2)

表7 云南附子中3种生物碱的含量 (μg/g,n=2)

表8 9批附片中3种生物碱的含量 (μg/g,n=2)

图3 四个产区附子(A)和江油附片(B)中3种生物碱的均值分布Fig.3 The average content of three alkaloids from four regions (A) and Fupian of Jiangyou (B)

2.10 正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)

为找出区分江油附子与其他非道地产区附子的关键成分，将色谱分析数据导入SIMCA 11.0 软件，以色谱峰的保留时间为变量ID，以样品编号(江油附子设为一组，编号为JY，将其他3个产区附子设为一组，编号为QT)为观察ID，构建OPLS-DA模型，OPLS-DA得分图见图4A，该模型的R2X=0.575，R2Y=0.902，Q2=0.646，表明该模型预测能力强。采用CV-ANOVA验证模型的可靠性，P值等于1.064×10-5，表明模型稳定可靠。从图4A可以看出，江油附子与其他产区附子分布区域明显不同。各变量VIP值图见图4B，其中，26.686(尼奥灵)，25.324 min的峰对分类具有显著影响(VIP值大于2.0)，表明尼奥灵为区分江油附子与其他产区附子的差异成分，这也印证了含量测定的分析结果，即江油附子中尼奥灵的含量显著高于其他产区附子。

图4 江油附子与其他产区附子的OPLS-DA得分图(A)和VIP值图(B)Fig.4 OPLS-DA score plot(A) and VIP plot(B) from the Fuzi of Jiangyou and other regions

3 结论

文献报道附子双酯型生物碱与其道地性相关[14-16]，但附子加工炮制后，双酯型生物碱转化为单酯型生物碱和原碱，使得不同产区附子中特征性差异成分双酯型生物碱发生转化，且附片成品中双酯型生物碱含量很低。而水溶性生物碱尼奥灵、附子灵、宋果灵为附子的固有成分，不会因加工炮制由酯型生物碱转化而来[17]，故本文考察附子水溶性生物碱与其道地性的相关性。

四个产区附子生长环境差异较大，江油海拔较低，气候湿润，降雨量充足，该地区附子中尼奥灵含量显著高于其他产区(> 880 μg/g)，均值约为云南、布拖产区的3.5倍，而云南与布拖产区海拔较高，昼夜温差大，光照充足，该地区附子中附子灵含量明显高于其他产区，均值约为陕西、江油产区的3倍，提示生态环境与生物碱的累积密切相关。江油附子栽培技术规范，精细化种植需修根、打尖、摘芽，附子个头较大，而陕西、云南附子种植方式粗犷，附子个头较小。布拖附子分布区域广，部分附子栽培较为规范，与江油附子种植方法相似，该部分附子个头、外观与江油附子相当，但尼奥灵含量(<700 μg/g)明显低于江油附子，显著不同。故推测尼奥灵含量的累积可能与江油独特的地理环境密切相关，影响附子道地性的主要因素可能为地理环境。此外，陕西产区3种水溶性生物碱的分布规律与江油类似，但尼奥灵含量也明显低于江油附子，约为江油附子的一半，且含量测定与OPLS-DA结果均证明尼奥灵为江油附子的差异性成分。因此，作者认为尼奥灵与附子道地性有相关性。

本文测定了江油附子炮制加工的蒸附片、炒附片以及生附片中3种水溶性生物碱的含量，结果同样证明，附片中尼奥灵含量最高。由此可见，尼奥灵作附片质量控制的指标性成分，能够实现将道地附片与非道地附片区分开来，破解非道地产区附子加工成附片，混淆江油附片销售的难题。但是对于传统炮制工艺加工的黑顺片、白附片等，经过胆巴水浸泡、漂洗、蒸煮等处理，水溶性生物碱几乎损失殆尽[17]，本文建立的测定方法还不能检出其水溶性生物碱的含量，其测定方法有待进一步研究。现代药理学研究表明，尼奥灵具有强心、抗炎镇痛等药理活性[8,9,11]。因此，尼奥灵作为附子及附片质量控制的一个评价指标能够彰显和弘扬江油附子的品牌、品质的优势特色，为建立科学合理的附子道地性品质评价方法和质量控制标准提供参考。