毛木耳黑色素提取条件优化及体外抗氧化活性研究

刘 鑫，袁 源，侯若琳，陈良韬，吴小平，郑明锋*，傅俊生*

1福建农林大学食品科学学院；2福建农林大学生命科学学院；3福建农林大学菌物研究中心，福州 350002

毛木耳(Auriculariapolytricha)属担子菌门、伞菌纲、木耳目、木耳科，是一种天然的食药两用真菌。其营养价值丰富，富含黑色素、多糖和蛋白质等多种活性成分[1-3]。大量研究表明，毛木耳具有良好的抗肿瘤等功效[4]。然而，目前关于毛木耳的研究仅集中在其蛋白质和多糖活性成分，而对其黑色素活性成分的研究却鲜有耳闻。以往研究表明，食药用真菌天然黑色素具有良好抗氧化、抗菌和抗肿瘤等生物活性，对人体健康作用重要，因而在生产生活中具有巨大的应用潜力和价值[5-7]。

黑色素是一种由酚或吲哚类化合物氧化聚合形成的非均质高分子量化合物[8]，溶于碱而不溶于水和其它有机溶剂，因此通常采用NaOH来提取[9]。本文主要探究了毛木耳黑色素的超声波辅助提取条件，并对黑色素体外化学抗氧化与细胞抗氧化活性进行研究，以期为毛木耳黑色素高效提取及其产品的应用开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验原料

毛木耳子实体干品购于福建省福州市大润发超市，外观呈耳状，黑色，背部有绒毛(由福建农林大学生命科学学院傅俊生副教授鉴定)。

1.2 主要药品试剂

氢氧化钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、硫酸亚铁、水杨酸等试剂均为国产分析纯；二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)(Sigma公司)；ABTS(Sigma公司)；四甲基噻唑蓝(MTT)(Sigma公司)；DCFH-DA活性氧检测试剂盒(碧云天公司)等。

1.3 主要仪器设备

PS-G60型洁康超声波机(洁康超声波设备有限公司)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；FE-20型pH计(梅特勒托利多仪器有限公司)；ST16R型离心机(美国Thermo公司)；CP-214型电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；Varioskan Flash型酶标仪(美国Thermo公司)等。

1.4 黑色素含量测定

通过扫描毛木耳黑色素纯品的紫外全吸收光谱，确定了毛木耳黑色素紫外的最大吸收波长在220 nm处(图1)，因而在此波长下检测吸光度，以氢氧化钠溶液为空白，绘制毛木耳黑色素含量标准曲线。根据公式(1)计算黑色素提取率。

提取率(%)=提取液中黑色素质量/

毛木耳子实体粉末质量×100%

(1)

1.5 毛木耳黑色素提取

参照Zou[10]等方法，并作适当修改。将干燥的毛木耳子实体粉碎→过80目标准筛→精确称取毛木耳子实体1.00 g，以料液比1∶30加入蒸馏水，90 ℃水浴30 min，10 000 rpm离心3 min，去除上清液，重复该步骤3次，除去多糖和蛋白质等水溶性杂质→按一定料液比加入NaOH溶液→在一定的超声功率和超声温度下提取毛木耳黑色素→提取结束后，于10 000 rpm离心5 min，收集上清液，用HCl将上清液的pH调节至1.5→80 ℃水浴加10 h→10 000 rpm离心3 min→收集沉淀，将沉淀依次用蒸馏水、95%乙醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚和75%乙醇洗至溶液无色，6 000 rpm离心去除清洗溶剂→将沉淀用NaOH溶解，再用HCl调节pH至1.5使黑色素重新沉淀→离心收集沉淀，将沉淀用0.1 M NaOH复溶，接着用0.1 M HCl调节pH至中性，流水透析48 h→冷冻干燥，得干燥的毛木耳黑色素纯品。

图1 毛木耳黑色素紫外全吸收光谱图Fig.1 Ultraviolet full absorption spectrum Auricularia polytricha

1.6 超声波单因素试验

以黑色素提取率为指标，分别研究NaOH浓度(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mol/L)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)、超声时间(10、20、30、40、50、60、70、80、90 min)、超声功率(200、250、300、350、400、450、500 W)和超声温度(20、30、40、50、60、70、80 ℃)五个因素对毛木耳黑色素提取率的影响，每组实验重复3次。

1.7 响应面试验

依据上述单因素实验结果，采用Desig-expert 8.0.6软件，根据Box-Behnken中心组合原理进行实验设计，以优化超声波辅助提取的毛木耳黑色素的工艺参数。响应面设计表见表1。

1.8 毛木耳黑色素红外光谱分析

将精制得黑色素粉末与KBr研磨混匀压片，在红外光谱仪上测定，采用2 cm-1的分辨率，扫描60次，扫描范围为400～4 000 cm-1。

1.9 毛木耳黑色素体外化学抗氧化活性分析

1.9.1 ABTS自由基清除率测定

参照Sun等法[11]，测定毛木耳黑色素对ABTS自由基的清除活性，实验每组重复3次，取平均值。

表1 Box-Behnken试验因素与水平

1.9.2 DPPH自由基清除率测定

参照Saiga等法[12]，测定毛木耳黑色素对DPPH自由基的清除活性，实验每组重复3次，取平均值。

1.9.3 羟基自由基清除率测定

参照Wang等法[13]。测定毛木耳黑色素对羟基自由基的清除活性，实验每组重复3次，取平均值。

1.10 毛木耳黑色素的体外细胞抗氧化活性分析

1.10.1 过氧化氢诱导L02肝细胞氧化损伤条件的确定

参照Li等[14]法，稍作修改，建立L02肝细胞氧化损伤模型。取对数生长期细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，接种于96孔细胞培养板，接种密度为1.0×105个/mL，培养24 h后分组培养。分为2组，空白对照组不加任何处理；模型组用不同浓度(25、50、100、200、400、800 μmol/L)H2O2处理。于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱培养24 h后，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2) -2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定细胞活力，以半数抑制浓度(IC50)为标准，来确定H2O2的造模浓度[15]。

1.10.2 毛木耳黑色素对过氧化氢诱导损伤的细胞活力影响

取对数生长期细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，接种于96孔细胞培养板，接种密度为1.0×105个/mL，培养24 h后分组培养。分为4组，空白对照组不加任何处理；模型组用200 μmol/L H2O2单独处理；毛木耳黑色素+H2O2组用不同浓度(1、2、4、6、8 mg/mL)毛木耳黑色素预处理1 h，再与200 μmol/L H2O2共孵育；样品对照组用8 mg/mL毛木耳黑色素单独处理。于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱培养24 h后，采用MTT法测定细胞活力。

1.10.3 毛木耳黑色素对H2O2诱导损伤的细胞形态的改善作用

取对数生长期细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，接种于6孔细胞培养板，接种密度为1.0×105个/mL,培养24 h后分组培养。分为3组，空白对照组不加任何处理；模型组用200 μmol/L H2O2单独处理；毛木耳黑色素+H2O2组用6 mg/mL毛木耳黑色素预处理1 h，再与200 μmol/L H2O2共孵育。分别在0、24、48 h观察细胞形态。

1.10.4 毛木耳黑色素对H2O2诱导损伤的L02细胞活性氧含量的影响

取对数生长期细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，接种于6孔细胞培养板，接种密度为1.0×105 个/mL,培养24 h后分组培养。分为3组，空白对照组不加任何处理；模型组用200 μmol/L H2O2单独处理；毛木耳黑色素+H2O2组用6 mg/mL毛木耳黑色素预处理1 h，再与200 μmol/L H2O2共孵育6 h。按照试剂盒说明书的方法，运用原位装载探针的方法进行胞内染色，染色30 min，然后用PBS充分清洗干净，使用荧光显微镜观察并拍照。

1.11 统计学处理

实验数据采用SPSS 13.0软件分析处理。计量资料数据用x±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 超声波单因素试验

2.1.1 NaOH浓度

在料液比1∶20、超声时间30 min、超声功率200 W、超声温度30 ℃的条件下，研究不同NaOH浓度(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mol/L)对毛木耳黑色素提取率的影响。从图2A中可以看出，毛木耳黑色素提取率随着NaOH浓度的增加呈现先升后降趋势，当NaOH浓度达0.3 mol/L时，黑色素提取率达到最大。因此，在NaOH浓度为0.3 mol/L的条件下提取黑色素比较适宜。

2.1.2 料液比

在NaOH浓度0.3 mol/L、超声时间30 min、超声功率200 W、超声温度30 ℃的条件下，研究不同料液比(为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)对黑色素提取率的影响。从图2B中可以看出，毛木耳黑色素提取率随料液比的增加呈现不断上升的趋势，当料液比超过1∶30后，提取率基本保持不变，考虑到料液比过大会造成溶剂浪费并且不利于后处理，因此，在料液比为1∶30的条件下提取黑色素比较适宜。

2.1.3 超声时间

在NaOH浓度0.3 mol/L、料液比1∶30、超声功率200 W、超声温度30 ℃的条件下，研究不同超声时间(10、20、30、40、50、60、70、80、90 min)对毛木耳黑色素提取率的影响。从图2C中可以看出，随着超声时间的推移，黑色素的提取率逐渐提高，当超声时间超过50 min时，黑色素的提取率趋于平衡。因此，在超声时间为50 min的条件下提取黑色素比较适宜。

2.1.4 超声功率

在NaOH浓度0.3 mol/L、料液比1∶30、超声时间50 min、超声温度30 ℃的条件下，研究不同超声功率(200、250、300、350、400、450、500 W)对黑色素提取率的影响。从图2D中可以看出，随着超声功率的增大，黑色素的提取率呈现逐渐上升的趋势，当超声功率为250 W时，黑色素提取率达到最高。当超声功率过高，黑色素的提取率发生了下降，这可能是由于过高的超声功率，破坏了黑色素的结构，从而降低了黑色素提取率，因此在超声功率为250 W的条件下提取黑色素较为适宜。

2.1.5 超声温度

在NaOH浓度0.3 mol/L、料液比1∶30、超声时间50 min、超声功率250 W的条件下，研究超声温度对毛木耳黑色素提取率(20、30、40、50、60、70、80 ℃)的影响。从图2E中可以看出，黑色素的提取率随超声温度的上升而逐渐提高，当超声温度上升至70 ℃后，黑色素提取率趋于平衡，温度过高可能会对黑色素的活性产生影响，且会加大能源的消耗。因此，在超声温度为70 ℃的条件下提取黑色素比较适宜。

图2 各超声单因素对毛木耳黑色素提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic single factor on extraction rate of melanin from Auricularia polytricha注：与前一条件相比较，*P<0.05。Note:Compared to the previous condition,*P<0.05.

2.2 响应面试验设计及结果

在超声波单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，选取A(NaOH浓度)、B(超声时间)和C(超声功率)为自变量，以黑色素提取率(Y)为响应值，设计3因素3水平的响应面分析试验。试验设计及结果见表2。

通过Desig-expert 8.0.6数据处理软件对表2毛木耳黑色素提取率进行响应面分析，得到A(NaOH浓度)、B(超声时间)、C(超声功率)3个因素与Y之间的回归方程：Y=9.18+0.19A+0.50B+0.42C+0.11AB+0.45AC+0.13BC-2.02A2-1.08B2-1.34C2。对此回归模型进行方差分析，该模型的P<0.01，说明该模型具有高度显著性。从表3可知，该回归方程的相关系数R2=0.997 9，说明该模型拟合度较好，可以真实的描述各个影响因子与响应值之间的关系。同时，失拟项不显著，说明回归方程与实际情况吻合的较好，实验误差小，因此可用该回归方程较好的分析和与预测最佳提取条件。

表2 响应面试验设计及试验结果

2.3 响应面优化及模型验证

通过对上述试验结果分析，可预测黑色素最优提取条件及提取率，由回归系数的显著性检验可知(表3)，模型的一次项A、B、C影响极显著(P<0.01)，二次项A2、C2、B2影响极显著(P<0.01)，交互项AC影响极显著(P<0.01)；根据一次项系数的绝对值可知，各因素对毛木耳黑色素提取率的影响主次顺序依次为超声时间>超声功率 > NaOH浓度。

根据回归分析结果绘制响应曲面，以确定NaOH浓度、超声功率和超声时间对毛木耳黑色素提取率的影响(图3)。通过该模型预测的最优提取条件为：NaOH浓度0.34 mol/L、超声时间52.48 min、超声功率259.65 W，在最优提取条件下，预测的黑色素提取率可达9.27%。

表3 回归模型的方差分析及显著性检验

续表3(Continued Tab.3)

来源Source平方和Sumofsquare自由度Df均方MeansquareFPBC10.0680.0684.970.0610失拟Lackoffit32.43E-038.08E-040.0350.9900残差误差Residualerror70.0950.014R2=0.9979纯误差Pureerror49.30E-022.30E-02AdjR2=0.9951合计Total1644.33

图3 响应面法立体分析图Fig.3 Response surface plot

2.4 模型预测结果验证及其与非超声组黑色素提取率比较

为验证模型预测的准确性，实验对预测参数进行了验证，为便于实际试验操作，对超声功率和超声时间参数进行取整，最终实际的提取条件为NaOH浓度0.34 mol/L、料液比1∶30、超声功率250 W、超声时间52 min、超声温度70 ℃。在此条件下重复3次实验，3次实验提取率的平均值为9.38%±0.15%(表4)，与理论预测值的相对误差在±0.12%内，由此可知，模型预测值和实际值之间有较好拟合性，能较好预测和分析不同条件下毛木耳黑色素提取率变化。

为验证超声波对毛木耳黑色素提取的促进作用，在进行最优条件验证的同时，还设置了非超声组进行对比(在实验条件控制上，除不超声外，其它条件均与超声组相同)。实验结果显示，超声波提取组的提取率相比于非超声组提高了16.09%(表4)，这与其它天然黑色素的超声提取结果变化趋势相似，表明超声波可以有效的提高黑色素提取率[16,17]。

表4 超声波组与非超声组毛木耳黑色素提取率比较

注：与非超声组相比较，*P<0.05。

Note:Compared to non ultrasonic group*P<0.05.

2.5 毛木耳黑色素红外光谱分析

黑色素在红外光谱中主要有以下主要特征吸收峰：吲哚环的N-H基团和OH基团在3300 cm-1左右产生的吸收峰，芳环C=C键或C=O键在1650 cm-1左右产生的吸收峰，以及芳环被取代形成共轭体系后在600～800 cm-1处所产生的弱吸收峰[18,19]。实验结果显示(图4)，超声波组与非超声组提取的毛木耳黑色素红外光谱主要特征吸收峰一致，表明超声波对毛木耳黑色素化学结构影响较小。

2.6 毛木耳黑色素体外化学抗氧化活性分析

实验进一步对毛木耳黑色素体外化学抗氧化活性进行分析。结果显示，毛木耳黑色素具有良好的化学抗氧化活性，当黑色素质量浓度达4 mg/mL，其对ABTS、DPPH和羟基自由基的清除率分别达96.46%±0.98%、55.30%±3.74%、52.80%±5.12%(图5)，该研究结果与黑木耳黑色素的抗氧化活性相比，毛木耳黑色素对DPPH和羟基自由基的清除活性较黑木耳黑色素低[7]，而对ABTS自由基清除活性与黑木耳黑色素相近[20]。

图4 超声波组与非超声组毛木耳黑色素红外光谱比较Fig.4 Comparison of infrared spectra of Auricularia polytricha melanin between ultrasonic group and non ultrasonic group

为探究超声波是否会对毛木耳黑色素的抗氧化活性产生影响，实验同时还对非超声组提取的黑色素化学抗氧化活性进行了研究。结果显示，超声波组与非超声组提取的黑色素清除ABTS、DPPH和羟基自由基的能力相近，表明超声波对毛木耳黑色素的抗氧化活性影响不大。

图5 超声波组与非超声组提取的毛木耳黑色素化学抗氧化活性对比Fig.5 Comparison of antioxidant activity of Auricularia polytricha melanin between ultrasonic group extraction and non ultrasonic group extraction

2.7 毛木耳黑色素体外细胞抗氧化活性分析

在确定超声波对毛木耳黑色素的化学结构和体外化学抗氧化活性影响不大后，实验进一步探究了超声波辅助提取的毛木耳黑色素对H2O2诱导的L02细胞损伤的保护作用，以分析毛木耳黑色素体外细胞抗氧化活性。

2.7.1 过氧化氢诱导L02肝细胞氧化损伤的浓度

研究首先考察了过氧化氢浓度对L02肝细胞损伤的影响，结果显示随着过氧化氢浓度的增加，细胞的存活率逐渐降低(图6A)，当过氧化氢浓度为200 μmol/L时，细胞的半数抑制浓度(IC50)约为50%，本研究选择造模浓度为200 μmol/L的过氧化氢进行后续试验。

2.7.2 毛木耳黑色素对过氧化氢诱导损伤的细胞活力影响

结果如图6B所示。与空白组相比，样品对照组浓度为8 mg/mL的毛木耳黑色素对细胞活力无显著影响，表明毛木耳黑色素对细胞没有毒副作用；与模型组(仅给予200 μmol/L H2O2)相比，毛木耳黑色素预处理能明显减轻H2O2导致的L02细胞活力下降，并呈剂量依赖性，当毛木耳黑色素浓度达6 mg/mL时，L02细胞存活率可达87.23%±8.72%(P<0.05)，表明毛木耳黑色素对H2O2诱导的L02细胞损伤有保护作用。浓度为8与6 mg/mL的毛木耳黑色素处理组对L02细胞的活力影响无显著性差异，因此选择浓度为6 mg/mL的毛木耳黑色素进行后续试验。

2.7.3 毛木耳黑色素对H2O2诱导损伤的细胞形态的改善作用

如图7A所示，空白组细胞以静态粘附方式生长，呈梭形或多角形。模型组(仅给予200 μmol/L H2O2)细胞逐渐收缩，形成球形，与周围细胞分离。与模型组相比，毛木耳黑色素能明显改善由H2O2诱导的细胞形态改变。

2.7.4 毛木耳黑色素对H2O2诱导损伤的L02细胞活性氧含量的影响

H2O2可以诱导细胞产生活性氧(ROS)，从而对细胞造成氧化损伤。从图7B可以看出，与空白组相比，模型组细胞内的ROS含量明显升高，使细胞内荧光强度明显增强，而毛木耳黑色素明显降低了由H2O2引起的细胞内ROS升高，进一步证实了毛木耳黑色素对H2O2诱导的L02细胞损伤具有保护作用。

图6 毛木耳黑色素对H2O2诱导损伤的细胞活力影响Fig.6 The effects of Auricularia polytricha melanin on H2O2-induced cell viability注：A.H2O2对L02细胞活力的影响，与空白组相比，*P< 0.05；B.木耳黑色素(APM)对H2O2诱导损伤的细胞活力影响，与空白组相比较，▲P< 0.05；与模型组相比，#P< 0.05。Note:A.The effect of H2O2 on the activity of L02 cells,compared to blank group *P< 0.05;B.The effects of Auricularia polytricha melanin on cell viability induced by H2O2,compared to blank group ▲P< 0.05,compared to model group #P< 0.05.

3 讨论

毛木耳因其丰富的营养价值和保健功效，深受广大消费者的喜爱。黑色素作为毛木耳的主要活性成分之一，在其生物功效上发挥着重要作用，如何高效提取毛木耳黑色素对毛木耳的生产应用十分重要。超声波辅助提取法是一种利用超声波产生强烈的振动而引起细胞壁的破坏，进而提高活性物质成分提取效率的方法，其具有提取时间短、提取效率高、环境污染小和成本低的优点[16]。因此，本实验采用超声辅助提取法提取毛木耳黑色素，并通过响应面法优化其提取工艺参数。实验结果表明，超声辅助提取法提取毛木耳黑色素的最佳提取工艺参数为：NaOH浓度0.34 mol/L，料液比1∶30，超声时间52 min，超声功率250 W，超声温度70 ℃。在最优条件下，毛木耳黑色素提取率可达到9.38%±0.15%，相比于实验设置的非超声组黑色素提取率提高了16.09%，表明超声波可有效提高毛木耳黑色素提取率。

大量研究表明，过氧自由基与人类许多疾病的发生有关，如心脑血管疾病、老年痴呆等，因此寻找天然高效的抗氧化剂具有重要意义[21]。实验进一步对超声波辅助提取的毛木耳黑色素体外化学抗氧化和细胞抗氧化活性进行分析，体外化学抗氧化实验结果表明，毛木耳黑色素具有良好的抗氧化活性，超声波辅助提取的毛木耳黑色素与非超声组提取得到的黑色素抗氧化活性相近，说明超声波不影响毛木耳黑色素的抗氧化活性，可以应用于毛木耳黑色素的高效提取。体外细胞抗氧化实验结果表明，毛木耳黑色素预处理能够明显减轻由H2O2导致的L02细胞活力下降及其细胞形态的改变，且降低细胞内ROS升高，说明毛木耳黑色素在体外对H2O2诱导的L02细胞损伤具有保护作用。该研究结果为毛木耳黑色素高效提取及其产品的应用开发提供科学依据。

图7 毛木耳黑色素对H2O2诱导损伤的细胞形态及其活性氧含量的影响Fig.7 The effects of Auricularia polytricha melanin on H2O2-induced cell morphology and the content of reactive oxygen注：A.毛木耳黑色素(APM)对H2O2诱导损伤的细胞形态的改善作用；B.毛木耳黑色素(APM)对H2O2诱导损伤的L02细胞活性氧含量的影响。Note:A.The improving effect of Auricularia polytricha melanin on cell morphology induced by H2O2;B.The effects of Auricularia polytricha melanin on the content of reactive oxygen species in L02 cells induced by H2O2.