辣椒疫病拮抗菌株筛选及防治效果研究

研究意义：辣椒疫病是由辣椒疫霉引起的具有毁灭性的土传病害，自该病被发现以来，在辣椒产区均有发生，除危害辣椒外，辣椒疫霉也可侵染番茄、茄子、黄瓜、西瓜、南瓜等多种作物，其发病速度快，传播范围广，是影响辣椒生产的最主要病害。辣椒是一种重要的蔬菜作物，在全世界都有普遍栽培，中国是辣椒生产大国。辣椒疫病的发生，不仅对辣椒产量造成重大损失，而且严重影响了辣椒的品质。目前防治辣椒病害最有效的手段是化学方法，然而化学方法防治病害副作用明显，带来农药残留超标、生态环境遭受破坏等一系列问题。因此，通过生物防治的方法来控制植物病害的发生，对绿色无污染农业的可持续发展日益重要。国内外许多研究证实，采用对辣椒疫霉具有拮抗作用的微生物防控辣椒疫病是一种环境友好型的有效方法，已取得较好的进展；其中，芽孢杆菌和木霉菌繁殖速度快、生命力强，并能产生有机酸、酶以及抗菌肽等丰富的代谢物，对植株具有促生作用，对病原菌具有寄生作用，被研究和应用较多。本研究切入点：目前对于生物防治的研究，主要集中在实验室阶段，有关室外的大面积应用相对较少，本研究以生防菌株和植物营养与生物肥料相结合的目的，开展相关研发工作。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试病原菌辣椒疫霉菌由湖南农业大学生物科学技术学院保存。

1.1.2 培养基改良PDA琼脂培养基、营养琼脂培养基。

1.1.3 供试辣椒品种湘研5号辣椒。

1.2 拮抗细菌的分离

1.2.1 土壤样品的采集从湖南浏阳、永州、郴州、湘西自治州等地采集健康辣椒植株及其根部土壤。土样采集方法，去除表层土壤，采取5~10 cm处的土样约200 g，拣出碎石，木屑等杂质，分装标记带回实验室。

1.2.2 样品分离利用稀释平板分离法，称取处理后的土样10 g，放入装有玻璃珠和90 mL无菌水的三角瓶中，震荡30 min。将混合均匀的液体，逐级以10倍稀释，分别吸取10-4、10-5、10-6、10-7稀释液100 μL加到营养琼脂培养基平板上，涂布均匀，将培养皿转移至35℃的温箱中，倒置培养1～2 d。

1.3 拮抗细菌的筛选

将活化的辣椒疫霉菌接种到PDA培养基上培养7 d，用直径7 mm打孔器打取生长良好菌饼，转接到PDA培养基的平板中央。以平板对峙的方法，将纯化后的细菌点接到辣椒疫霉菌饼四周对称位置，30℃下培养7 d后，待对照皿中辣椒疫霉菌丝铺满培养皿时，测量菌落直径，计算抑制率，抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100。

1.4 拮抗细菌HNND-5的鉴定

1.4.1 拮抗菌形态特征、培养特征观察及生理生化试验

1.4.2 16S rDNA 测序及序列分析

采用试剂盒提取菌株H N N D-5的总D N A，试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，以PCR 扩增，正向引物5’-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3’ 反向引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ PCR反应体系（20μL）：10×Buffer 2μL，Taq 酶0.4μL，dNTP 2 μL，引物各1μL，以ddH2O补足。PCR扩增程序：95℃ 5 min；95℃ 45 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环；72 ℃10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物切胶回收测序，测序工作由华大基因完成，测序结果通过GenBank进行Blast序列同源性比对。

1.5 盆栽试验

1.5.1 辣椒疫霉菌悬浮液制备 将在PDA培养皿活化的辣椒疫霉病菌菌丝块接种于装有200 mL PDB培养液的500 mL三角瓶中，每瓶接种3块，28℃，160 r/min培养5~7 d，然后将辣椒疫霉菌培养液倒入组织捣碎机中，制成菌丝悬浮液备用。

1.5.2 拮抗菌发酵液制备将筛选出的细菌（HNND-5、NTGB-113、NTGB-114、NTGB-116）接种到NB（蛋白胨 10 gL-1，牛肉浸出粉5 gL-1，NaCl 5 gL-1）中，于30℃，160 r/min培养1 d待用，测定各菌株发酵有效活菌数，然后将发酵置于4℃条件下保存待用。

1.5.3 试验方法

（1）试验设计试验设计5个处理，分别为NB培养基（CK）、HNND-5发酵液、NTGB-113发酵液、NTGB-114发酵液、NTGB-116发酵液。4组拮抗菌发酵液用无菌水稀释至1×106cfu/mL，辣椒疫霉病病菌悬浮液用无菌水稀释至1×108cfu/mL。九孔营养钵中每孔钵2粒辣椒种子，待辣椒长至3~4片叶时，于每株辣椒苗根际施用5 mL相对应拮抗菌发酵液和NB培养基，然后每个处理施加辣椒疫霉病病菌悬浮液5 mL。

发病率（%）=（发病株数/调查总株数）×100%；

防治效果（%）=[1-处理组发病株率/对照发病株率]×100%。

定义两个坐标系，惯性坐标系OXYZ，质心O为地球中心，以赤道平面为基准，Z轴垂直于平面，Y轴进行右手系方向；小行星轨道坐标系LVLH（oxyz），质心在小行星的中心，轨道平面为基准，z轴垂直于平面，y轴进行右手系方向，如图2所示：

（2）测定方法测量从辣椒基部至主茎顶部之间的距离为株高。将辣椒植株从近根结的第一个节点剪断，分别称取上半部分和根系部分质量，标记为鲜质量，放于105℃杀青10 min，然后放于85℃烘箱中，烘至恒重，分别称量，标记为干质量。

2 结果与分析

2.1 不同菌株对辣椒疫霉菌的抑制效果

从辣椒植株根际土壤中筛选出4株对辣椒疫霉有拮抗作用的细菌。从表1可以看出，通过平板对峙试验，测得4株拮抗菌抑制率为65.34%~67.00%。其中以HNND-5细菌的抑菌效果最好，为67.00%，明显高于其他菌株。抑菌试验结果表明：通过分离筛选辣椒根际土壤中的微生物，可以获得许多对辣椒疫霉具有抑制作用的拮抗菌。

表1 拮抗菌对辣椒疫霉菌的抑制测定结果

2.2 菌株HNND-5的鉴定

2.2.1 菌株HNND-5形态学特征和生理生化特征在NA固体培养基上，菌株HNND-5菌落成圆形、乳白色，边缘不规则，凸起，表面湿润，革兰氏染色为阳性，细胞呈长杆状，有芽孢。结合拮抗菌株HNND-5生理生化特征（见表2）和形态特征，初步判定HNND-5菌株属于芽孢杆菌属。

项目 反应 项目 反应革兰氏反应 + 5%NaCl +苯丙氨酸脱氢酶 + 10%NaCl +V-P测定 + 接触酶 +葡萄糖产酸 + 明胶水解 +蔗糖产酸 + 淀粉水解 +

葡萄糖产气 - 纤维素水解 +蔗糖产气 - 柠檬酸盐利用 +吲哚反应 - 硝酸盐还原 +

2.2.2 16SrDNA序列分析与系统进化树利用PCR回收产物直接测序，通过DNAMAN软件拼接后得到菌株HNND-5的16SrDNA部分有效序列，序列长度为1 347bp，NCBI登录号为KY441416，将该序列与GenBank中己知序列进行对比，结果显示：菌株HNND-5 与甲基营养型芽孢杆菌（登录号：JQ765434.1）的序列相似性为100%。采用邻接法构建菌株HNND-516S基因序列系统发育树，菌株HNND-5与甲基营养型芽孢杆菌处于同一分支，亲缘关系最近且遗传距离一致。

2.2 不同菌株对辣椒生长的影响

通过施用拮抗菌发酵液，辣椒株高增长，上半部分鲜、干质量及根系鲜、干质量均高于CK。在株高方面，与CK相比较，其他4个处理都有明显优势，其中HNND-5提高12.00%，NTGB-113提高20.68%，NTGB-114提高14.19%，NTGB-116提高13.41%。上部干鲜比重，五个处理差异不明显，HNND-5和NTGB-113为0.94，NTGB-114和NTGB-116为0.91，CK为0.91。根系干鲜比重，HNND-5和NTGB-113明显优于CK，相比CK而言，分别增加16.90%和18.31%。

2.3 不同处理对辣椒疫病发生情况的影响

通过不同处理，辣椒疫病发病情况差异明显。试验结果显示：4株拮抗菌的防治效果为57.94%~73.02%，其中以HNND-5细菌的防治效果最好，为73.02%，明显高于其他菌株。防治效果试验结果表明：拮抗菌发酵液可有效地降低辣椒疫病的发病情况，具有良好的防病能力。

3 讨论

试验结果表明，从辣椒根际筛选的HNND-5菌株对辣椒疫霉的抑制作用显著，其平板对峙试验的抑制率为67.00%，且对黄瓜枯萎病菌、马铃薯立枯病菌等土传性病原菌有明显的抑制作用。通过试验可知HNND-5菌株发酵液对辣椒的生长、鲜重、干重具有明显的促生作用。与对照相比较，HNND-5菌株发酵液可使辣椒株高增加12.00%，根系干鲜比重增加16.90%，上部干鲜比重增长不明显。在防治效果方面，HNND-5菌株发酵液的防效达到73.02%；NTGB-113、NTGB-114、NTGB-116等也有明显的防治效果。

芽孢杆菌是生物防治中应用最多的一类微生物，在水稻根系土壤中首次分离得到甲基营养型芽孢杆菌并开展大量研究工作，后续研究发现甲基营养型芽孢杆菌对辣椒黑胫病菌、香蕉枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄青枯菌、番茄灰霉病菌、立枯丝核菌及水稻稻瘟病菌具有较强的抑制活性。本研究筛选出的HNND-5菌株具有明显抑制辣椒疫霉病菌的作用，且抑菌谱较广，这与他人的研究结果相一致。

4 结论

从土壤中筛选的拮抗菌株对植物病原菌的生长有明显的抑制作用；拮抗菌发酵液对植物的生长有明显的促进作用，在较大程度上提高植物的干物质量；施用拮抗菌发酵液后，植物抵抗植物病原菌侵染的能力显著提高，发病率明显降低。