校正系数F在青钱柳代用茶检验过程中的应用

摘 要：青钱柳代用茶黄酮单体成份检测过程中“样品回流后冷却称重，加入纯甲醇至回流前重量”步骤，在实际操作过程中要求做到“衡重”存在一定弊端、难度和安全风险。本文减少“衡重”实验步骤引入校正系数F参与计算（简称方法2），通过分析纯甲醇的毒性、减少不确定度因素提高不确定度及减少实验过程工作量等考虑因素提出方法2的必要性;通过对Fv与Fm计算及验证，2例实例计算Fv与Fm相对误差值0.17%和0.45%，均远远小于5%，得出方法2检验的可行性和一致性;通过分析比较2种方法6种检测目标物的RSD值（n=5）1.35%～4.48%，均小于5%，得出2种检验方法结果的一致性。

关键词：青钱柳代用茶检测;校正系数F;应用

基金项目：湖南省食品药品监督管理局“湘西州人工种植青钱柳的质量安全性评价及青钱柳叶代用茶质量标准研究”（项目编号：湘食药科R201726）  青钱柳为胡桃科青钱柳属植物，我国独有单种属植物，属国家二级保护树种，别名金钱柳、铜钱树、摇钱树等。主要生长在中国南部海拔 420～2500m 的高山野外，现也有部分人工种植林，较多见于湖南、江西等省份，湖南省境内主要分布在湘西州和邵阳市等市州。青钱柳是一种食药两用植物，其叶、花、果均可入药，其叶在食品加工领域中可作为新食品原料（中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2013年第10号公告），食品加工领域一般用青钱柳叶加工成代用茶，我国湖南、江西等省份己有部分企业获得青钱柳叶代用茶食品生产许可证。

现代药学及食品加工业研究表明青钱柳叶中含有一定量的黄酮类化合物，并有一定的药理活性。王克全等在青钱柳化学成分及药理作用的研究进展，研究表明青钱柳中主要含有三萜皂苷、黄酮、甾体、萜类、有机酸、生物碱等类型成分，并且具有降血糖、降血脂、降血压、增强免疫力、抗氧化和防衰老等药理活性[1];张学英等在茶叶和3种代用茶总黄酮及9种单体化合物分析中研究表明青钱柳中含有綠原酸、异槲皮素等黄酮单体物质[2]。经查资料，青钱柳叶代用茶中黄酮及黄酮类化合物的检测方法主要有分光光度计法、薄层色谱法、高效液相色谱法等，液相色谱法常用于黄酮单体的检测，章发盛等研究了HPLC法同时测定青钱柳叶中绿原酸等4种多酚酸的含量[3];张学英等研究了高效液相色谱法同时测定青钱柳叶中异槲皮素等5种黄酮单体的含量研究[4];陈丹等研究了湖南绥宁青钱柳中槲皮素、山柰素含量测定[5] ;郦宏岩等研究了HPLC测定青钱柳中槲皮素和山柰素的含量[6]。经查资料，黄酮单体检测在样品前处理过程中，一般处理步骤是“样品中加入一定量的70%（或其他浓度）甲醇回流冷却称重，并加入纯甲醇（或其他浓度）至回流前重量”[3-8]，但在实际操作过程中要求做到“衡重”存在一定弊端和难度，比如冷却程度不彻底使衡重称重不稳、加入纯甲醇至“衡重”操作控制难精准到位、长时间使用纯甲醇对于检测人员身体有一定伤害风险（甲醇：CH3OH是结构最为简单的饱和一元醇，无色有酒精气味易挥发的液体，分子量32.04，沸点64.7℃;甲醇对人体有强烈毒性，甲醇在人体新陈代谢中会氧化成比甲醇毒性更强的甲醛和甲酸，饮用含有甲醇的酒可引致失明、肝病、甚至死亡），应尽量减少实验步骤比如二次称量，以减少工作量且提高检测不确定度等。本试验在样品前处理过程中减少“加入纯甲醇至回流前重量”操作步骤，引入校正系数F参与计算，并通过校正系数F验证和样品平行检测分析比较，得出通过减少实验步骤引入校正系数F方法的必要性、可行性和2种方法一致性。

1 试验材料

1.1 仪器

试剂高效液相色谱仪器（安捷伦1260，带自动进样装置，PAD检测器）;BSA-224S分析天平;JY502电子天平;ZWT-H1-20超纯水机;电热恒温水浴锅;常用玻璃器皿等。甲醇（HPLC，含量≥99.9%）;乙腈（HPLC，含量≥99.9%）;乙醇（HPLC，含量≥99.8%）;磷酸;0.1%磷酸水溶液（自配）;超纯水（自制）。

1.2 标准品

混合标准液本试验用安谱实验室技术（上海）有限公司生产的标准品，共9种黄酮单体标准品：芦丁（CAS号153-18-4，纯度99.3%）;异槲皮素（CAS号482-35-9，纯度99.6%）;槲皮素（CAS号117-39-5，纯度98.8%）;山奈素（CAS号491-54-3，纯度99.5%）;山奈酚（CAS号520-18-3，纯度98.9%）;新绿原酸（CAS号906-33-2，纯度99.9%）;绿原酸（CAS号327-97-9，纯度99.7%）;隐绿原酸（CAS号905-99-7，纯度99.6%）;咖啡酸（CAS号331-39-5，纯度98.1%）。配制成2种混合标准使用液：混标使用液1，浓度分别为芦丁136ug/mL、异槲皮素82ug/mL、槲皮素64ug/mL、山奈酚70ug/mL和山奈素148ug/mL;混标使用液2，浓度分别为新绿原酸84ug/mL、绿原酸102ug/mL、隐绿原酸110ug/mL和咖啡酸64ug/mL。

1.3 试验样品

试验样品来源于湘食药科[R201726]课题的科研样品及青钱柳叶代用茶成品。科研样品为2017-2018年春夏秋三季由科研人员野外现场采摘鲜叶，在试验室内加工制成。

2 试验方法

2.1 样品前处理方法

2.1.1 样品前处理方法1（简称方法1）

准确称取过60目筛青钱柳粉碎样品约0.5g（准确至0.0001g）至250mL三角瓶中，准确加入30.0mL70%甲醇水溶液称重记数，加装回流装置于80℃水浴锅中恒温回流2h，取出冷却至室温再次称重，并用纯甲醇补至回流前的重量（即衡重），混均过0.45μm滤膜，待上机[3-8]。

2.1.2 样品前处理方法2（简称方法2）

准确称取过60目筛青钱柳粉碎样品约0.5g（样品重M、准确至0.0001g）至250mL三角瓶中（空瓶重M0），准确加入30.0mL70%甲醇水溶液（称重记数M'），加装回流装置于80℃水浴锅中恒温回流2h，取出冷却至室温再次称重（再次称重记数M"），混均过0.45μm滤膜，待上机。

2.2 液相色谱检测条件及系统适用性

2.2.1 液相色谱检测条件

色谱柱C18（4.6×250mm，5μm）;流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，按流动相A（1～7分）10%→（7～13分）10%～16%→（13～14分）16%→（14～17分）16%～24%→（17～24分）24%→（24～32分）24%～50%→（32～45分）50%→（45～53分）10%时间和比例进行梯度洗脱;进样量20ul;检测柱温30℃;检测时间53min每针。

2.2.2 系统适用性

取异槲皮素等5种混合标液1及单一标准品，用高效液相色谱仪PAD检测器进行三维扫描光谱分析，混合标液1色谱图见图1，其它检测数据及分析见表1。

通过三维扫描图谱分析，异槲皮素等5种黄酮单体在360nm处色谱图响应值最大、基线平稳、峰形好，故360nm为5种黄酮单体检测波长[4]。从图1和表1可见异槲皮素等5种黄酮单体分离效果很好，理论塔板数均远远大于4000;分离度均远远大于1.5;标准系列线性回归方程相关系数均很接近1。证明液相色谱检测系统适用性良好。

另取绿原酸等4种混合标液2及单一标准品，用高效液相色谱仪PAD检测器进行三维扫描，混合標液2色谱图见图2、其它检测数据及分析见表2。

通过三维扫描图谱分析，绿原酸等4种多酚酸在326nm处色谱图响应值最大、基线平稳、峰形好，确定326nm为4种多酚酸检测波长[5]。从图2和表2可见绿原酸等4多酚酸分离效果好，理论塔板数均远远大于4000;分离度均大于1.5;标准系列线性回归方程相关系数为1或很接近1。证明液相色谱检测系统适用性良好。

3 校正系数F及验证

3.1 相关试剂

室温环境下测定相关试剂的密度，检测数据及分析见表3至表5。

由表3可见超纯水（自制）平均密度为1.0057g/mL，RSD值为0.41%;由表4可见色谱纯无水甲醇平均密度为0.7890g/mL，RSD值为0.19%，同时检测值与理论值的相对误差0.35%远小于10%;由表5可见70%甲醇水溶液平均密度为0.8545g/mL，RSD值为0.22%，同时检测值与理论值的相对误差9.6%小于10%，综上分析本试验所用相关试剂均理想。

从以上2个计算实例分析，可见回流过程跑走纯甲醇量比例为7.61%和3.92%，均小于10%，说明回流过程中跑走的纯甲醇量比例较小，并不影响整个试验合理性;2个计算实例Fv与Fm相对误差值为0.17%和0.45%，均远远小于5%，说明2种系数验证法计算结果很接近且能相互验证一致性;比较2种验证法计算难易程度Fv比Fm难些，但从一般样品前处理定容检验步骤的理解Fv比Fm更易于理解，因为检验检测“定溶”一般以液体体积为准，而本试验是以“质量定容”为准。综合以上分析以Fm应用于本试验校正系数，且通过Fv和Fm验证试验可行性和一致性。

3.4 2种方法的检测结果分析

比较用2种方法检测同一样品（n=5），所得样品重现性检测数据及结果分析，见表6。

从表6分析可见，用2种前处理方法检测9种黄酮单体物质，其中检出的6种目标物RSD值（n=5）1.35%～4.48%，均小于5%，说明2种前处理B方法检测结果相符即2种前处理方法的一致性。

4 结论

方法1在实际操作过程中要求做到“衡重”存在一定弊端和难度：比如液体冷却程度不彻底或液体固有挥发性使称重不稳;加入纯甲醇至“衡重”操作控制难精确到位;长时间使用纯甲醇对于检测人员身体有一定伤害风险;宜尽量减少实验步骤比如二次称量，以减少工作量且提高检测不确定度等（即方法2必要性）;方法2通过减少实验步骤引入校正系数法，从而减少实验工作量及实验安全性，提高检测不确定度。分析纯甲醇的毒性、减少不确定度因素提高不确定度及减少实验过程工作量等考虑因素提出方法2的必要性;通过对Fv与Fm计算及验证，两例实例计算Fv与Fm相对误差值0.17%和0.45%，均远远小于5%，得出方法2检验的可行性和一致性;通过分析比较2种方法6种检测目标物的RSD值（n=5）1.35%～4.48%，均小于5%，得出2种检验方法结果的一致性。

参考文献

[1] 王克全，曹莹.青钱柳化学成分及药理作用的研究进展[J].黑龙江医学，2007，31（08）：577-579.

[2]张学英，章发盛.茶叶和三种代用茶总黄酮及9种单体化合物分析[J].中国标准化，2018（11）：198-194.

[3]章发盛，张学英.HPLC法同时测定青钱柳叶中绿原酸等4种多酚酸的含量[J].中国标准化，2018（11）：200-206.

[4]张学英，章发盛.高效液相色谱法同时测定青钱柳叶中异槲皮素等5种黄酮单体的含量研究[J].中国标准化，2019（02）：153-157.

[5]陈丹，史蕾喆.湖南绥宁青钱柳中槲皮素、山柰素含量测定[J].科技创新导报，2014（27）：234-238.

[6]郦宏岩，朱惠芬.HPLC测定青钱柳中槲皮素和山柰素的含量[J].药学与临床研，2009（04）：300-302.

[7]吴琳琳，姚文丽.10个采收期青钱柳HPLC指纹图谱建立及4种成分测定[J].中成药，2017（02）：347-352.

[8]李春娜，范冰舵.HPLC-DAD波长切换法同时测定青钱柳提取物中5种有效成分[J].辽宁中医杂志，2015，42（6）：1283-1285.