硫酸庆大霉素盐酸林可霉素注射液细菌内毒素检查法的建立

王凡 王小婷 李艳华 郭文欣,*

(1 黑龙江省兽药饲料监察所，哈尔滨 150069；2 大庆市大同区农业农村局，大庆 163515；3 东北农业大学，哈尔滨 150030)

硫酸庆大霉素盐酸林可霉素注射液是由本实验室研制的主要治疗由链球菌、支原体、衣原体等感染引起的猪呼吸道疾病综合征的兽用复方注射液，主要成分是硫酸庆大霉素和盐酸林可霉素，两种药物分别作用于敏感菌核糖体的不同点位，最终阻碍了细菌细胞合成蛋白质。由于两种药物单独使用不能有效治疗由混合细菌感染引起的呼吸道疾病，且耐药问题限制了两种药物在临床上的单独使用，经过研究表明，两种抗菌药物联合使用后主要表现为相加或协同作用，同时减少细菌的耐药性[1-3]。因此，开发硫酸庆大霉素盐酸林可霉素注射液具有重要的临床价值。根据2015版《中国兽药典》制剂通则项下要求，注射用药需进行细菌内毒素检查，保证用药安全。本研究参考2015版《中国兽药典》附录1143“细菌内毒素检查法”项下凝胶法[4]的要求，对本品复方注射液细菌内毒素的限度设定和检查方法做了相关研究。

1 试验材料

1.1 仪器

DHG-9070 A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；XW-80 A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；TAL-40型恒温试管仪(湛江安度斯生物有限公司)。

1.2 试药

硫酸庆大霉素盐酸林可霉素注射液(批号：20160401、20160402及20160403，为河南牧翔动物药业有限公司生产的中试产品)；细菌内毒素工作标准品(批号：1602010，规格：10EU/支，湛江博康海洋生物有限公司)；鲎试剂1(TAL，批号：1601091，标示灵敏度：0.125EU/mL，湛江博康海洋生物有限公司)；鲎试剂2(TAL，批号：1601105，湛江安度斯生物科技有限公司，标示灵敏度：0.125EU/mL)；细菌内毒素检查用水(BET，批号：1601270，规格：10mL，湛江安度斯生物有限公司)

2 方法与结果

2.1 样品细菌内毒素限值(L)的确定

参考2015版中国药典通则[5]，根据公式L=K/M，式中K=5EU/(kg·h)，M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量。然而，兽药方面尚未建立完善的细菌内毒素限值确定方法。本研究中参考2015版《中国兽药典》[4]中硫酸庆大霉素注射液及盐酸林可霉素注射液细菌内毒素限值要求，其规定庆大霉素中含内毒素的量应小于0.50EU/mg，林可霉素中含内毒素的量应小于0.50EU/mg。因本品为硫酸庆大霉素与盐酸林可霉素组成的复方注射液，其含量为庆大霉素每毫升150万单位，林可霉素75mg/mL。因此，为保障本品质量，确保动物用药安全，将本品的细菌内毒素限度制定为单方硫酸庆大霉素注射液和盐酸林可霉素注射液细菌内毒素限度所含最低值，即按照本品中含量规格较小的盐酸林可霉素的限度要求(林可霉素中含内毒素的量应小于0.50EU/mg)，则换算为硫酸庆大霉素盐酸林可霉素注射液细菌内毒素的限值为注射液中细菌内毒素不超过37.5EU/mL。

2.2 最大稀释倍数(MVC)确定

根据细菌内毒素最大稀释倍数计算公式：MVD=cL/λ，其中L为细菌内毒素限值，当L以EU/mL表示时，则c=1.0mL/mL。由此可以得出，最大稀释倍数(MVD)为300倍。

2.3 TAL灵敏复核试验

鲎试剂灵敏度复核按《中国兽药典》2015年版附录1143“细菌内毒素检查法”[4]进行，根据TAL灵敏度的标示值，将细菌内毒素工作标准品用BET水溶解，用封口膜封严，在旋涡混合仪上充分混合15min，然后将混匀的细菌内毒素工作标准品溶液稀释成2λ、λ、0.5λ和0.25λ 4个浓度，取复溶后的规格为每支0.1mL的TAL原安瓶18管，其中4管加入0.1mL浓度为2λ的细菌内毒素标准溶液，4管加入0.1mL浓度为λ的细菌内毒素标准溶液，4管加入0.1mL浓度为0.5λ的细菌内毒素标准溶液，4管加入0.1mL浓度为0.25λ的细菌内毒素标准溶液；另外2管加人0.1mL BET水作为阴性对照。取不同厂家的2批鲎试剂分别进行试验，结果见表1。2个厂家鲎试剂灵敏度均在0.5～2.0λ范围内，灵敏度均符合规定。

表1 鲎试剂灵敏度复核结果Tab.1 The results oflimulus reagent sensitivity re-check

2.4 供试品干扰预试验

将3批供试品溶液分别用BET水稀释至原浓度的1、50、100、200和300倍。同时每一稀释度下均制备含有2λ浓度细菌内毒素的溶液作为供试品阳性对照系列(PPC)。另外取4支，其中2支加0.2mL的检查用水，记作NC。另外2支分别加0.1mL的检查用水和0.1mL浓度为2λ内毒素标准溶液，记作PC。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。结果见表2，由结果可知，本品注射液最小不干扰稀释倍数为100倍。

2.5 供试品干扰试验

按TAL灵敏度复核试验项下，细菌内毒素标准溶液的配制方法，BET水制成浓度分别为2、1.0、0.5和0.25λ 4种标准溶液。将3批硫酸庆大霉素盐酸林可霉素注射液稀释100倍，用100倍稀释液将细菌内毒素标准品制成浓度为2.0、1.0、0.5和0.25λ 4种供试溶液。同时做阴性对照(NC)及供试品阴性对照(NPC)，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。按公式Es=lg-1(∑Xs/4)和Et=lg-1(∑Xt/4)，计算各系列反应终点内毒素浓度的绝对值。结果见表3。由表3可见，Es均在0.5～2.0λ范围内，且Et在0.5～2.0Es范围内，表明本注射液在100倍稀释下不干扰细菌内毒素检查。

2.6 供试品中细菌内毒素检查

根据上述干扰试验结果，将3批样品均稀释100倍，用此稀释溶液配制浓度为2λ的溶液，作为供试品阳性对照(PPC)。同时做阳性对照(PC)及阴性对照(NC)。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作，对3批中试供试品进行细菌内毒素检查。结果见表4，取两个厂家鲎试剂对3批中试注射液进行细菌内毒素检查，其结果全部小于预设限值，符合规定。

表2 干扰试验预试验Tab.2 The results of preliminary interference test

表3 供试品干扰试验结果Tab.3 The results ofinterference test

3 讨论

药品的细菌内毒检查法是一项快速、简便、标准化程度高的检测方法，《中国兽药典》2015版附录[4]中利用鲎试剂来检测或量化细菌内毒素，并认定供试品中细菌内毒素是否符合限度要求。本品注射液中细菌内毒素检查方法为凝胶法，确定本品注射液细菌内毒素限值为37.5EU/mL，最大稀释倍数为300倍。对两个厂家生产的鲎试剂进行灵敏度复核后，进行供试品预干扰试验和干扰试验，确定本品最小稀释倍数为100倍。通过两个厂家鲎试剂对3批中试注射液进行检查，结果显示其细菌内毒素均小于规定限值，本品注射液细菌内毒素符合规定，该方法操作简单、可靠，结果准确。

表4 供试品内毒素检验结果Tab.4 The results of bacterial endotoxin test