气相色谱法测定头孢妥仑匹酯中N,N-二甲基甲酰胺残留量

王晨 李东伟 崔晨辉 王晶,* 王彦广

(1 浙江大学，杭州 310027；2 浙江华方药业股份有限公司，台州 318020)

头孢妥仑匹酯是日本明治制果株式会社研发的第四代口服头孢菌素[1]，于1994年4月在日本上市，2001年4月在中国上市，商品名为美爱克(Meiact)。头孢妥仑对革兰阳性菌及革兰阴性菌具有广泛而强大的抗菌作用，对临床主要感染病菌的体外活性要优于头孢地尼和头孢呋辛，具有抗菌谱宽、临床疗效确切，安全稳定，口服吸收好、血药浓度高、体内分布广等特点，临床应用广泛[2-4]。

头孢妥仑匹酯已经收录于日本药典(JP)17[5]和韩国药典第十版[6]，但是并没有对其残留溶剂进行规定，中国药典2015年版也没有对头孢妥仑匹酯进行规定。在头孢妥仑匹酯的生产工艺中主要使用了二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、DMF等多种有机溶剂[4,7-9]，根据中国药典的要求—“如生产过程中引入或产品中残留有机溶剂，均应按通则‘残留溶剂测定法’检查并应符合相应溶剂的限度规定”[10]，有必要对头孢妥仑匹酯的的残留溶剂进行检测。DMF在中国药典和《残留溶剂的指导原则》(ICH Q3C)中被定义为第二类溶剂，为应限制使用，能导致动物非遗传毒性致癌或可能导致其他不可逆毒性反应的试剂，规定其限度为0.088%[11-12]。原料药中DMF残留量的检测方法已经有较多的研究和报道，主要运用气相色谱法进行检测，由于DMF的沸点较高，基本采用直接进样的方式[13-16]，但目前尚未见头孢妥仑匹酯中DMF残留量检测方法的报道。本文参考中国药典2015年版通则0861残留溶剂检查法[11]和相关文献[17-18]，建立了气相色谱法测定头孢妥仑匹酯中DMF残留量的方法，该方法简便、准确、灵敏。

1 仪器与试药

Agilent 7890B气相色谱仪(美国Aglient公司)；ME204E电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

头孢妥仑匹酯(浙江华方药业股份有限公司提供，批号：180501、180502和180503)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF，Merck，色谱纯)；二甲基亚砜(DMSO，Honeywell，色谱纯)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DB-624(30m×0.53mm,3.0μm)；检测器：FID；柱温：程序升温，初始柱温110℃，保持5min，再以30℃/min的速率升至200℃，保持5min；进样口温度：230℃；检测器温度：250℃；载气：N2；载气流速：3.0mL/min；进样体积：1.0μL；分流比：2:1。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制

精密称取DMF 44.4mg，置于100mL量瓶中，用DMSO稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密量取对照品储备液5mL，置于50mL量瓶中，加DMSO至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品液的配制

取供试品500.0mg，精密称定，置于10mL量瓶中，加DMSO使其溶解，稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.3 供试品和对照品混合溶液的配制

取供试品500.0mg，精密称定，置于10mL量瓶中，加对照品溶液使其溶解，稀释至刻度，摇匀，作为供试品和对照品混合溶液。

2.3 专属性考察

取对照品溶液、供试品溶液、供试品和对照品混合溶液以及空白溶剂DMSO分别进样，记录色谱图。结果表明，空白溶剂对供试品测定无干扰，各色谱峰之间的分离度均大于1.5，各组分分离良好，供试品中其他组分对测定结果不影响，方法专属性好，色谱图见图1。

2.4 检测限和定量限的测定

取对照品溶液，逐步稀释至相关浓度，使DMF的信噪比(S/N)为3.0时，即为DMF的检测限，浓度为0.777μg/mL，换算样品浓度后为0.002%；使DMF的信噪比约为10.0时，即为DMF的定量限，浓度为2.664μg/mL，换算样品浓度后为0.005%。取定量限溶液，连续直接进样6针，峰面积RSD为0.47%，符合要求，色谱图见图2。

图1 专属性考察色谱图Fig.1 Chromatograms of specificity test

2.5 线性与范围试验

精密量取对照品储备液0.5、2.5、4.0、5.0、6.00和7.5mL，分别置于50mL量瓶中，加DMSO稀释，配制成10%、50%、80%、100%、120%和150%浓度的溶液，摇匀，进样分析，记录色谱图。以峰面积Y为纵坐标，浓度X(μg/mL)为横坐标，进行线性回归，得线性方程：Y=1.1867X+0.77739，r=0.9993，表明DMF浓度在4.44～66.60μg/mL范围内，峰面积与浓度线性关系良好，结果见表1和图3。

2.6 准确度(回收率)试验

图2 定量限测定色谱图Fig.2 Chromatograms of the limit of quantitation

表1 线性试验结果Tab.1 Linear test result

图3 DMF的标准曲线Fig.3 Standard curve of DMF

精密量取对照品储备液0.8、1.0和1.2mL，分别置于10mL量瓶中(约相当于限度的80%、100%和120%)，加入已测定DMF残留量的供试品(180503，未检出)约500.0mg，精密称定，用DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀，作为回收率测试液，每个浓度配制3份，直接进样，记录色谱图，计算DMF的量、回收率，平均回收率和RSD，结果见表2。表明DMF的回收率都在95%～105%，平均回收率为100.72%，回收率的相对标准偏差为1.76%，符合要求。

2.7 精密度(重复性)试验

按对照品溶液的配制方法配制对照品溶液，进样测定分析，平行操作6次，结果DMF峰面积的RSD为1.09%(n=6)，表明该方法精密度良好，结果见表3。

2.8 耐用性考察

在其他条件不变的情况下，考察了流速为2.8和3.2mL/min，起始柱温为105和115℃，更换同一型号不同编号的色谱柱时，测试结果的变化。结果表明，在以上条件下，获得的色谱图中各溶剂峰理论塔板数均大于5000，各色谱峰之间的分离度均大于1.5，对照品溶液中DMF峰面积RSD均符合规定，方法耐用性良好，结果见表4。

2.9 样品的测定

按供试品溶液的配制方法配制供试品溶液，进样测定，记录色谱图，采用外标法计算样品中DMF的残留量，结果见表5。

3 讨论

表2 DMF回收率数据Tab.2 Results of recovery test of DMF

表3 精密度试验数据Tab.3 Results of precision test

表4 耐用性试验结果Tab.4 Results of durability test

表5 样品检测结果Tab.5 Results of sample analysis

3.1 色谱柱的选择

头孢妥仑匹酯在生产中曾使用二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、DMF等多种有机溶剂，在选择色谱柱时重点考察了拖尾因子，排除其他溶剂对测定的干扰。实验中先后尝试了HP-5和DB-1毛细管柱，发现拖尾因子均大于3，拖尾严重。使用DB-624色谱柱时，DMF峰形明显改善，其理论塔板数和拖尾因子都好于前两种色谱柱，符合要求。而且二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯和乙醇等有机溶剂对测定无影响，适用于检测DMF的残留量。

3.2 溶剂的选择

头孢妥仑匹酯不溶于水，溶于DMF、N,N-二甲基乙酰胺和二甲亚砜，因测定DMF残留，不能使用DMF作溶剂。采用N,N-二甲基乙酰胺作溶剂时，由于N,N-二甲基乙酰胺中含有DMF，同样会对测定有干扰。因此，选择二甲亚砜作为溶剂。

3.3 柱温的选择

本方法采用程序升温，首先以初始柱温110℃保持5min，再以30℃/min的速率升至200℃保持5min，可以缩短测定时间，较快除去残留溶剂，避免影响后续样品的测定。