A/Guangdong/Th005/2017(H7N9)禽流感病毒对禽类致病力的研究

吕琦，李枫棣，龚姝然，戚菲菲，王顺意，王冠澎，姜静，鲍琳琳

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室，新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室，北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

H7亚型在禽类间早已存在。有记载的最早疫情是1904年由H7N7亚型禽流感病毒导致的意大利鸡瘟。此后H7亚型在自然界持续存在，并于2000年前后多次在意大利的鸡群中爆发(H7N1/H7N3)[1]。截至2013年，H7亚型禽流感病毒已导致7000万禽类死亡，波及区域遍布全球。2013年初，出现H7N9感染人的病例[2]。随后H7N9持续流行，共发生5波大的流行，在2017年第5波流行开始，发生多起家禽疫情，禽类出现死亡，并且能从禽类体内分离出H7N9禽流感病毒，H7N9病毒已从低致病性向高致病性转变[3]。

H7N9对禽的致病力变化引起了多方的关注，为了确定第5波疫情中H7N9病毒株对禽的致病力，我们选用第5波H7N9分离株A/Guangdong/Th005/2017(Th005)，以第1波H7N9分离株A/Anhui/1/2013(Anhui)作为参比，通过测定鸡IVPI确定2波流行株对禽致病力的变化；通过2株病毒感染鸡后体温、体重、临床症状以及排毒情况分析比较2株病毒对鸡的致病的特点；通过病毒在鸡中的传代实验分析H7N9禽流感病毒在禽体内循环后病毒对禽致病力变化，以及病毒在禽中的流行趋势。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

42只SPF级白来航鸡，6周龄，体重为(600 ± 50)g，由北京勃林格殷格翰维通公司提供【SCXK(京)2014-0002】，对其进行筛选，选出对于目前流行的流感病毒血清抗体(抗H1、H3、H5、H7)均为阴性者。感染实验按照世界卫生组织(World Health Organization, WHO)指导原则，均在动物生物安全三级实验室中进行(卫ABSL3-021)，所有操作经中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所伦理委员会审核并批准(批准号：BLL17005)，实验动物的使用遵循3R原则。

1.1.2 病毒

(1)H7N9禽流感病毒：A/Guangdong/Th005/2017(H7N9)(简称Th005)由中国科学院微生物所惠赠，A/Anhui/1/2013(H7N9)(简称Anhui)由中国疾病预防控制中心病毒预防控制研究所提供。

(2)Th005鸡传代株(简称Th005 C)：由原代病毒静脉感染实验鸡，取实验鸡死亡当天的鼻拭子上清和肺部组织研磨液于鸡胚中扩增。

(3)Anhui鸡传代株(简称Anhui C)：由原代病毒静脉感染实验鸡，取感染后第5天的鼻拭子上清于鸡胚中扩增。

1.1.3 试剂与仪器

RDE酶(receptor-destroying enzyme)(Sigma，C8772-1VL)，火鸡血(中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物资源北方中心)，胎牛血清(Gibco，16140-071)，青/链霉素(penicillin/streptomycin)双抗生素溶液(Gibco，15140-122)，MEM培养基(Gibco，11095-098)。

生物安全柜(Thermo，1287，美国)，二氧化碳细胞培养箱(Thermo，371，美国)，-80℃超低温冰箱(Thermo，905，美国)，15 mL、50 mL管离心机(Sigma，6K15，美国)，1 mL管台式离心机(Kubota，日本)，电动研磨器/均质器 (Retsch，#MM400，德国)。

1.2 方法

1.2.1 Th005和Anhui毒株的鸡静脉注射致病指数IVPI评分的比较

Th005和Anhui毒株分别感染6周龄白来航鸡，每组10只，鸡翅下静脉注射0.1 mL病毒稀释液，病毒稀释液采用生理盐水10倍梯度稀释，感染后连续10 d记录实验鸡临床症状和死亡率。IVPI实验评价方法参考世界动物卫生组织(Office International des épizooties, OIE)评分标准[4]：IVPI指数为每只鸡为期10 d的平均临床症状观察分数，24 h内动物完全死亡为3分，10 d内动物完全无症状为0分。评分1.3以上则判定病毒为高致病性禽流感病毒。症状评分：0为正常，1为生病，2为严重生病，3为死亡；以下症状中呈现一种为“生病”，呈现两种或两种以上为“严重生病”：呼吸系统相关症状、精神沉郁、腹泻、头冠发紫，头面水肿，神经系统症状。

1.2.2 Th005、Th005 C、Anhui和Anhui C毒株感染鸡致病力的比较

Th005、Th005 C、Anhui、Anhui C毒株分别滴鼻感染6周龄白来航鸡，每组5只，感染剂量为每只106TCID50，感染后第0 ～ 14天，测定体重和肛温；第0 ～ 7、9、11、14天收集咽、肛拭子测定病毒滴度。

1.2.3 滴度的测定

10倍梯度稀释待检测拭子，稀释液接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL病毒稀释液，37℃，5%CO2，孵育1 h 后，吸走上清，培养板中加入200 μL病毒培养基(MEM 培养基中加入100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素)，3 d后，取细胞上清，用1%火鸡血测定凝血活性，判定细胞感染情况。利用Reed-Muench计算组织细胞半数感染量(50% tissue culture infective dose, TCID50)[5]。

1.3 统计学分析

运用SPSS 11.5软件包对本实验中数据进行处理，实验结果以平均值±标准差表示，不同组间的数据差异采用ANOVA单因素方差分析，两组之间则采用t检验分析组间差异是否显著，P< 0.05 则认为结果差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Anhui和Th005毒株的鸡静脉注射致病指数(IVPI)评分比较

静脉感染Th005毒株后，实验鸡1 d内全部死亡，IVPI指数为3；感染Anhui株后，实验鸡10 d内均无临床症状出现，IVPI指数为0。根据OIE文件中IVPI评判要求，Anhui株为低致病性禽流感毒株，Th005株为高致病性禽流感毒株。

2.2 Anhui和Th005及传代株感染鸡的致病力比较

2.2.1 Anhui和Th005及传代株感染鸡后临床症状和体征比较

Anhui、Anhui C、Th005和Th005 C毒株分别滴鼻感染白来航鸡，每组5只，连续称重14 d，感染后Anhui 和Anhui C组实验鸡体重持续增长，但Anhui C组比Anhui组实验鸡体重增长更缓慢；Th005和Th005 C组实验鸡均出现体重下降，两组间鸡体重下降率无显著性差异(图1)。

图1 Anhui和Th005及其传代株感染实验鸡体重变化率Figure 1 Body weight change rate of the Anhui, Th005 and their progeny-infected chickens

Anhui、Anhui C、Th005和Th005 C毒株分别滴鼻感染白来航鸡，每组5只，感染后连续14 d检测体温，Anhui和Anhui C组实验鸡体温在正常范围内波动(40.5 ～ 42℃)，各组间体温无显著性差异；感染后第2天，Th005和Th005 C组实验鸡体温超过42℃，体温超过正常范围，此后感染鸡体温降低直至死亡，各组间体温无显著性差异(图2)。

图2 Th005、Anhui及其传代株感染实验鸡体温变化Figure 2 Body temperature of the Anhui, Th005 and their progeny-infected chickens

Anhui、Anhui C、Th005和Th005 C毒株分别滴鼻感染白来航鸡，每组5只，感染后14 d内记录鸡的存活率，Anhui和Anhui C组实验鸡在感染后14 d内均未出现死亡；Th005和Th005 C组实验鸡感染后3 ～ 5 d内全部死亡(图3)。

图3 Th005、Anhui及其传代株感染实验鸡存活率Figure 3 Survival rate of the Anhui, Th005 and their progeny-infected chickens

Anhui、Anhui C、Th005和Th005 C毒株分别滴鼻感染白来航鸡，每组5只，感染后14 d内观察鸡的临床症状和体征变化，Anhui组实验鸡无症状，Anhui C组实验鸡在感染后第5天出现了一过性头面水肿及结膜炎，症状持续1 d后消失；Th005和Th005 C组实验鸡在感染后第2天出现食欲降低，进食量减少，感染后第3天开始出现精神沉郁、体表瘀斑、肉垂紫绀、头面水肿和死亡(图4)。

2.2.2 Anhui和Th005及其传代株感染鸡后排毒情况比较

Anhui、Anhui C、Th005和Th005 C毒株分别滴鼻感染白来航鸡，每组5只，感染后第0 ～ 7、9、11、14天收集咽、肛拭子测定病毒滴度。Anhui和Anhui C组实验鸡咽拭子未检测到病毒滴度；Anhui组实验鸡肛拭子未检测到病毒滴度，Anhui C组肛拭子在感染后第2 ～ 9天能够检测到病毒复制，在感染后第7天病毒滴度达到峰值(102.58TCID50/mL)(图5)。

Th005和Th005 C组鸡咽拭子能够持续检测到病毒复制，病毒滴度持续上升直至实验鸡全部死亡，在感染后第4天和第3天病毒滴度到达最高值，分别为104.33TCID50/mL和103.89TCID50/mL；鸡肛拭子同样能够持续检测到病毒复制，滴度持续上升至实验鸡全部死亡，在感染后第4天和第3天到达峰值，分别为105TCID50/mL和 105.37TCID50/mL。同时，肛拭子的滴度峰值要高于咽拭子(图5)。

3 讨论

自2013年我国发现全球首例人感染H7N9禽流感病毒病例以来，该病毒持续流行于我国家禽中。在前4波流行中，一直对禽无致病性。然而，从2017年第5波流行开始，我国禽类养殖场出现禽类死亡，并能从禽类体内分离出H7N9禽流感病毒[2]。为了确认第5波疫情中H7N9病毒对禽的致病力变化，我们选取第5波病毒分离株Th005代表株感染禽类，以第1波分离株Anhui株作为参比，比较其对禽的致病力的变化。

通过鸡的静脉致病指数IVPI测定可以看出：Anhui株为低致病性禽流感病毒株，Th005株为高致病性禽流感病毒株。Anhui株感染鸡后没有任何症状，但是Anhui株在鸡体内传代后感染鸡，在感染后2 ～ 9 d，肛拭子可以持续检测到病毒滴度。这说明Anhui株在禽类循环中可能获得了新的宿主嗜性，对禽类的致病性逐渐增强；并且通过泄殖腔持续向外界排毒，使H7N9增加了接触其他宿主的机会，从而持续传播。这为第1波疫情爆发后，持续出现5次疫情提供了依据。并且H7N9通过持续向外界排毒，进而达到在禽类中的反复适应，逐渐增强对禽类的致病力，这也能部分解释疫情中H7N9为何可以从无致病性向高致病性的转变。

注：感染后鸡咽拭子中病毒滴度：(A)Th005组，(B)Anhui组，(C)Th005 C组，(D)Anhui C组；感染后鸡肛拭子中病毒滴度：(E)Th005组，(F)Anhui组，(G)Th005 C组，(H)Anhui C组。图5 Th005、Anhui及其传代株滴鼻感染实验鸡的咽、肛拭子病毒滴度Note. Viral titers in oropharyngeal swabs from chickens:(A)Th005,(B)Anhui,(C)Th005 C,(D)Anhui C; Viral titers in cloacal swabs from chickens:(E)Th005,(F)Anhui,(G)Th005 C,(H)Anhui C.Figure 5 Viral titers in oropharyngeal swabs and cloacal swabs of the Th005, Anhui, and their progeny infected chickens

Th005及其传代株感染鸡后，3 ～ 5 d内全部死亡。另外，咽试子和肛拭子能够分离出高的病毒滴度，并逐渐升高一直持续到病死，肛拭子的病毒滴度峰值高于咽拭子。结合Anhui感染鸡的排毒情况，可以看出H7N9禽流感病毒感染禽类后泄殖腔为重要的病毒复制及排毒通道。Th005的传代株较原始株相比，致病力基本不改变，均对鸡呈现高致病性，说明Th005对禽类不但保持高致病能力，还可在禽类循环后依旧保持高致病能力，也说明了H7N9病毒依然具有在禽中持续流行并对禽类具有高致病力的能力，提示农业部门应对H7N9保持高度警惕并采取防范措施。

另外，笔者对Anhui、Th005及其传代株测序结果分析：与Anhui株比较，Th005株在HA裂解位点有“-KRIA-”碱性氨基酸的插入，提示Th005株已具备高致病性禽流感的分子特征[6-7]，这很可能是H7N9病毒由低致病性转变为高致病性的重要原因。Anhui C与Anhui比较，在HA节段上发生了N133D和N158-159D的双突变，Pantin-Jackwood 等[8-9]认为HA-N133D/N158-159D双突变可以降低HA的热稳定性并且增加HA蛋白对禽类唾液酸受体的结合能力，这也从分子水平上证实了H7N9在禽间循环过程中逐渐获得了宿主嗜性，这与我们实验中Anhui传代株较原始株相比对鸡的致病力增强的结果相吻合。