家蚕5龄幼虫中肠磷酸酶活性分析

唐芬芬

摘要    以家蚕为试验材料，调查了5龄幼虫从起蚕到熟蚕中肠酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）酶活性变化。结果表明，AKP酶活性呈现出先升高后降低的趋势，其中在5龄起蚕和熟蚕时酶活性较低，而在盛食期（5龄第5天）活性最高;而ACP在5龄初期酶活性较低，从5龄第4天开始升高，随后维持在一个较高的水平上。

关键词    5龄家蚕;中肠;酸性磷酸酶;碱性磷酸酶;酶活性

中图分类号    S883        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）17-0224-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

磷酸酶是一类能分解磷酸酯的水解酶，昆虫机体存在2种磷酸酶（Phosphatase），一种是酸性磷酸酶（Acid Phos-phatase，ACP），另一种是碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）。酸性磷酸酶（ACP）在酸性条件下催化磷酸单酯水解和磷酸基因的转移，在生物体代谢调节、能量转化、信号传导以及蛋白（酶）的去磷酸化等过程发挥重要作用[1]。该酶不仅参与昆虫中肠营养物质的消化、吸收、运输，而且是生物体内重要的解毒物质，广泛存在于动物、植物及微生物体内，是一种对底物专一性较低的磷酸单酯水解酶;同时，在生物体内的营养物质代谢中具有重要的生物学功能。ACP在细胞内主要存在于溶酶体中，在细胞核、胞液、微粒体、高尔基体中也有存在[1]。碱性磷酸酶（AKP）是一类非特异性磷酸水解酶，该酶广泛存在于人、动物、植物与微生物中，在生物体内直接参与了磷酸基团的转移和代谢过程，在对杀虫剂的抗性形成和对内源或外源化合物（包括植物产生的次生物质）的解毒代谢方面起着重要作用[2-3]。家蚕ACP主要参与营养物质的消化、吸收、运输，在蚕丝蛋白合成中也发挥了重要作用[4]。昆虫的中肠是分泌众多酶类的组织，也是消化吸收营养的主要部位[5]。本试验以5龄家蚕幼虫为研究对象，测定了家蚕整个5龄期中肠ACP和AKP的酶活性，为深入了解家蚕中肠磷酸酶的变化规律提供参考。

1    材料与方法

1.1    试验材料

供试家蚕品系为菁松×皓月，于恒温培养箱26 ℃桑叶饲养至5龄。取5龄起蚕（标记为0 d）至熟蚕（标记为7 d）的中肠，每次取样均设3次重复，每个重复取5头蚕，样品收集后置于-80 ℃保存备用。

1.2    酶液制备及活性测定

酶液的制备：取家蚕中肠样品，加入4 ℃预冷的1.0 mL磷酸钾缓冲液（0.1 mol/L，pH值7.0），在冰上匀浆，4 ℃条件下、8 000 r/min离心5～8 min，收集上清液。按照南京建成生物科技有限公司ACP测试盒（货号：A060）和AKP（货号：A059-1）测试盒说明书测定酶ACP和AKP活性。

蛋白质含量测定：参照杨伟克等[6]的方法，其主要测定原理是蛋白质分子具有-NH3+基团，当棕红色考马斯亮兰显色剂加入到蛋白标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3+结合，使溶液变为蓝色，通过测定595 nm处吸光度可计算出蛋白含量。每个样品重复3次，取其平均值，下同。计算公式如下：

待测样品蛋白浓度（g/L）=[（测定OD值-对照OD值）/（标准OD值-空白OD值）]×标准品浓度（0.563 g/L）

2    结果与分析

在家蚕整个5龄期不同发育阶段中肠磷酸酶活性变化如图1所示。从图1可以看出，家蚕5龄幼虫从起蚕到熟蚕，碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性变化并不一致。AKP酶活性表现为先升后降的变化趋势，5龄起蚕（第0天）AKP酶活力最低，在第1天和第2天AKP活力略有增加，从第3天酶活力开始逐渐升高，在第5天酶活力最高（28.95 U），在第7天急剧下降至5.19 U，略高于起蚕。ACP酶活性呈现逐渐升高的趋势，从5龄起蚕至第3天，酶活性较低，在第4天开始增加，此后就维持在一个较高的水平上。

3    结论与讨论

酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）是一类能分解磷酸酯的水解酶，广泛存在于昆虫体内，在昆虫生长发育及抗逆性方面都发挥了重要作用[2]。中肠是家蚕的重要组织之一，主要负责营养物质的消化与吸收，桑叶中的糖类、蛋白质和脂类等大分子化合物首先在中肠消化液的作用下分解成小分子化合物，经中肠上皮细胞吸收，再通过血液运输到其他组织[7-8]。家蚕中肠磷酸酶（ACP和AKP）活性与家蚕的生理状况密切相关，在一定程度上反映了中肠对桑叶等营养物质消化吸收能力的强弱[9]。

本研究结果显示，碱性磷酸酶（AKP）活力在家蚕的整个5龄期呈先升高后降低的变化趋势，其活性变化规律与该龄期家蚕的食量及生理进程趋于一致。5龄家蚕一般在第4～5 天达到盛食期，AKP酶活性即在第5天相对较高，盛食期家蚕对营养物质的需求量很大，摄食量增加，AKP酶活性此时维持一个相对较高的水平，主要参与中肠营养物质的代谢吸收。酸性磷酸酶（ACP）酶活性呈现逐渐升高的趋势，在5龄初期较低，后期就维持在一个较高水平上。在5龄中期以前，食用的桑叶蛋白质以用于初蚕生长为主，5龄后期，蚕体生长已基本完成，继续食用一定量的桑叶合成氨基酸和蛋白质，用于吐丝营茧。ACP酶活性从5龄第4天开始急剧增强，随后维持一个较高的水平，表明ACP在5龄家蚕后期丝蛋白的合成以及磷酸物质的转移、消化、吸收等方面发挥重要作用。

4    参考文献

[1] 赵志刚.德国小蠊的抗药性及其几种相关酶活性关系的研究[D].济南：山东师范大学，2009.

[2] 严盈，彭露，刘万学，等.昆虫碱性磷酸酶的研究进展[J].昆虫学报，2009，1（8）：95-105.

[3] 王猛.家蚕氨肽酶N基因和碱性磷酸酶基因在中肠组织的表达分析[D].镇江：江苏科技大学，2013.

[4] 陈志伟，贾秀英.氟对家蚕血液及中肠磷酸酶活性的影响[J].农业环境保护，2002，21（2）：130-133.

[5] 冯丽春，沈卫德.蚕体解剖生理学[M].北京：高等教育出版社，2015：77-81.

[6] 杨伟克，唐芬芬，刘增虎，等.1-脱氧野尻霉素对家蚕中肠BmSuc1基因表达及其酶活性的影响[J].江苏农业科学，2016，44（11）：290-292.

[7] 侯勇，官建，赵萍，等.家蚕中肠组织蛋白质组学研究[J].蚕业科学，2007，33（2）：216-222.

[8] 耿磊.家蚕中肠及围食膜与BmNPV互作蛋白的鉴定[D].合肥：安徽农业大学，2016.

[9] 刘震，鲍先巡，尤征英，等.家蚕对BmNPV抗病性与中肠消化酶活性的关系[J].安徽农业大学学报，2009，36（3）：489-492.