HPLC测定芙蓉散中芦荟大黄素和大黄酸的含量

首都医科大学附属北京中医医院（100010）庄志宏 吴剑坤

北京市卫生局临床药学研究所（101300）姜迪 张林华

芙蓉散是北京中医医院法定制剂，主要成分有芙蓉叶、生大黄、黄芩、黄连、关黄柏、泽兰、冰片，具有清热解毒，消肿止痛的功效[1]。医院皮科、外科应用治疗阳性肿疡50多年来取得了良好的效果，为了有效控制产品质量，针对目前执行的《北京市医疗机构制剂规程》中芙蓉散只是采用薄层色谱法进行定性鉴别，本实验研究采用高效液相法测定大黄的主要成分芦荟大黄素、大黄酸的含量，为建立全面的质量标准提高依据。

1 材料

1.1 仪器 日立L-2000型高效液相色谱仪；D-2000工作站；岛津AUW-220D分析天平等。

1.2 样品与试剂 芦荟大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110795-201710）；大黄酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110757-201607）；芙蓉散（北京中医医院提供，批号：1709015）；乙腈（色谱纯，天津市光复科技有限公司）；纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈（B）和0.1%磷酸水（A）为流动相梯度洗脱，梯度洗脱条件详见下附表1；柱温30℃；检测波长256nm；进样量10μL；理论塔板数按芦荟大黄素及大黄酸计算不低于2500，样本色谱图如附图所示。

附表1 梯度洗脱色谱条件

附表2 芙蓉散中芦荟大黄素含量测定结果

附表3 芙蓉散中大黄酸含量测定结果

附表4 正交试验考察因素水平表

附表5 正交试验及结果（芦荟大黄素）

附表6 正交试验及结果（大黄酸）

附表7 工艺验证实验结果

2.2 芦荟大黄色对照品溶液制备 精密称取芦荟大黄素对照品1.66mg，置于10mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得芦荟大黄素为0.166mg/mL的对照品溶液。

大黄酸对照品溶液制备：精密称取大黄酸对照品2.06mg，置于50mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得大黄酸为0.0412mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 精密称取芙蓉散5g，按照正交试验优选的实验条件进行提取，放冷至室温，用相应溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液5～25ml容量瓶中，加相应溶剂稀释至刻度。过0.22μm滤膜，作为供试品溶液进行HPLC含量测定。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取2、5、10、15、20μL的芦荟大黄素对照品溶液，按照上述色谱条件，测定峰面积。以进样含量（μg）为横坐标，以色谱峰面积值为纵坐标进行线性回归，得到芦荟大黄素的的回归方程为Y=589485.6518X+8587.1707；R2=0.9999＞0.999，芦荟大黄素在0.332～3.32μg范围内与峰面积呈良性线性关系。分别精密吸取5、10、20、30、40μL的大黄酸对照品溶液，按照上述色谱条件，测定峰面积。以进样含量（μg）为横坐标，以色谱峰面积值为纵坐标进行线性回归，得到大黄酸的的回归方程为Y=1223833.9747X-4130.5549；R2=1.0000＞0.999，大黄酸在0.206～1.648μg范围内与峰面积呈良性线性关系。

附图 芙蓉散色谱图

2.5 精密度试验 分别精密吸取芦荟大黄素、大黄酸对照品溶液10μL，连续进样5次，按照2.1项下色谱条件分别测定芦荟大黄素和大黄酸的峰面积值。计算芦荟大黄素及大黄酸的峰面积相对标准偏差（RSD）（n=5）分别为1.57%、1.00%，表明进样精密度良好。

2.6 稳定性试验 取芙蓉散供试品溶液，按上述色谱条件于0、2、4、8、24h进样，结果，供试品溶液中芦荟大黄素峰面积的RSD为1.76%（n=5），供试品溶液中大黄酸峰面积的RSD为2.04%（n=5），表明供试品溶液中的芦荟大黄素、大黄酸成分在室温放置24h内基本稳定。

2.7 回收率试验 精密称取已测含量的同一批号芙蓉散样品6份，每份2g，分别加入一定量的芦荟大黄素和大黄酸标准品，按照上述色谱条件进行测定。分别计算芦荟大黄素和大黄酸的回收率。芦荟大黄素的平均回收率为92.36%，RSD为1.95%。大黄酸的平均回收率为95.46%，RSD为1.86%。见附表2、3。

2.8 芙蓉散供试品溶液制备方法考察及结果

2.8.1 正交试验设计考察提取方法 根据前期预实验，选取提取溶剂、溶媒用量、超声时间作为考察因素，应用L9（34）正交设计表进行试验，因素水平见附表4。

2.8.2 正交试验 根据正交试验设计，精密称取芙蓉散5g，按照正交试验安排提取，放冷至室温，用相应溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液5～25ml容量瓶中，加相应溶剂稀释至刻度。过0.22μm滤膜，作为供试品溶液进行HPLC含量测定。精密吸取各供试品溶液10μL，按照2.1项下方法进行含量测定，结果见附表5、6。

2.8.3 结果分析 由极差分析结果可知，各因素对芦荟大黄素、大黄酸含量的影响顺序为A＞B＞C，即提取溶剂＞溶媒用量＞超声时间。故应选取A3B3C2为最佳提取方案。

2.9 验证试验 根据正交试验结果对A3B3C2工艺条件重复3次试验，以验证该提取方法的合理性和稳定性，结果测定芦荟大黄素的平均含量为6.41mg/g，RSD=2.17%；大黄酸的平均含量为5.71mg/g，RSD=2.68%。见附表7。

3 讨论

芙蓉散方中芙蓉叶具有凉血解毒、消肿止痛作用，生大黄清热解毒、祛瘀生新，在方中芙蓉叶、生大黄为君药，黄芩清热解毒、泻火燥湿，助君药清热解毒。局部用药可使肿疡得以消散，即使难以完全消散也可使肿势局限，拔脓外出[2]。大黄的主要成分是芦荟大黄素和大黄酸[3]，本次研究制定的方法简便、准确、重现性好，以本法测定芦荟大黄素、大黄酸的含量可作为芙蓉散的质量控制标准。