吸附交联法固定化蔗糖异构酶及其在异麦芽酮糖制备中的应用

耿梦华 ，陈 晟 ，吴 敬 ，吴 丹 *

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.江南大学，江苏 无锡 214122；3.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

异麦芽酮糖（isomaltulose），又名帕拉金糖，是蔗糖的同分异构体[1-3]。与蔗糖相比，异麦芽酮糖热量低、甜度低、不致龋齿[4]。人体食用异麦芽酮糖后，会在血液中以较缓慢的速度代谢为果糖和葡萄糖，不影响体内胰岛素的分泌，特别适合于糖尿病人及肥胖人群食用[5]。因此，现在越来越多的人开始关注和食用异麦芽酮糖。

异麦芽酮糖的生产方法主要有生物转化法和化学转化法。由于化学转化法的高能耗、高污染等问题，目前国内外生产异麦芽酮糖普遍采用基于生物催化的蔗糖异构化法[6-12]，即利用微生物合成的蔗糖异构酶（EC 5.4.99.11，sucrose isomerase，SIase）以蔗糖为底物酶转化生产异麦芽酮糖，催化作用反应式如图1。生物转化法主要有细胞转化法和酶转化法两种。细胞转化法是直接发酵菌体或将菌体固定化来转化蔗糖。生产强度低、菌体浓度低及易污染杂菌等问题是在利用细胞转化法生产异麦芽酮糖时无法避免的，而酶转化法一般不存在上述问题，所以目前一般是将蔗糖异构酶从微生物细胞中提取出来，再通过游离酶或固定化酶将蔗糖转化为异麦芽酮糖。相比于游离酶，固定化酶由于其良好的操作稳定性及存储稳定性、产物易分离等优点而使酶的工业化应用更加经济。

目前关于蔗糖异构酶固定化的报道较少。国外仅见FABIANO等[13]以硅藻土吸附法与微胶囊包埋法两种方法对Erwinia sp.来源的蔗糖异构酶进行固定化，然而这两种方法所制得的固定化酶酶活力回收率及操作稳定性都较差；国内仅见南京工业大学的WU等[14]以ε-poly-L-lysine修饰过的介孔TiO2为载体对蔗糖异构酶进行固定化，所得固定化酶具有良好的操作稳定性与酶活力回收率，且材料较为新颖，但是考虑到成本问题，此方法并不能用于大规模的工业化生产。因此，寻求一种成本经济、操作简单、酶活力回收率高且操作稳定性良好的蔗糖异构酶的固定化方法仍然是目前亟待解决的问题。

图1 蔗糖异构酶生物催化蔗糖反应式Fig.1 Reaction of sucrose isomerase biocatalysis sucrose

壳聚糖是天然的碱性多糖，吸附性强，常用于酶的固定化[15-16]。本研究拟以壳聚糖微球为载体、戊二醛为交联剂，对重组工程菌来源的蔗糖异构酶进行固定化，考察各种固定化条件对酶活回收率的影响，并对固定化酶的最佳转化条件及固定化酶重复使用稳定性进行探讨，以期为提高蔗糖异构酶的利用效率、降低异麦芽酮糖的生产成本提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

菌种：短小芽孢杆菌（B.brevis/pSVEB-palILSP）由本实验室保藏。

试剂：牛肉蛋白胨（CP）购自杭州木木生物科技有限公司，大豆蛋白胨（CP）购自上海国药集团化学试剂有限公司，壳聚糖（脱乙酰度＞90%，CP）购自上海国药集团化学试剂有限公司，戊二醛（CP）购自阿拉丁公司，异麦芽酮糖、海藻酮糖（GR）购自Sigma公司，其他试剂均为国产AR级。

仪器：AR 2140型电子天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，冷冻立式离心机购自日本Hitachi公司，Agilent 1200高效液相色谱购自美国Agilent公司，小型高速离心机购自德国Eppendorf公司，UV-1100紫外可见分光光度计购自日本Shimadzu公司，空气恒温摇床购自上海精密仪器仪表有限公司，HZ-9212 SB水浴恒温振荡器购自太仓市华利达实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蔗糖异构酶游离酶的制备 将藏于本实验室-80℃冰箱的短小芽孢杆菌甘油管以体积分数2‰的接种量接种于含有30 μg/mL新霉素的10 mL的 TM 培养基中，于200 r/min、30℃培养 8～10 h，制得种子液。按体积分数1%的接种量将种子液转接入含有30μg/mL新霉素的50 mL的TM培养基，30℃，200 r/min培养48 h后，将发酵液在12000 r/min、4℃下离心10 min，上清液即为SIase粗酶液。

1.2.2 蔗糖异构酶固定化方法的优化 壳聚糖载体的制备：将一定质量的壳聚糖溶解于体积分数2.0%的醋酸溶液中，待形成均一透明的胶体后用注射器将其滴加到4 mol/L的氢氧化钠溶液中（滴加时注意针头与液面的距离并保持垂直），形成直径为2.0 mm左右的微球，后用蒸馏水洗至中性。将制好的壳聚糖微球加入到一定浓度的戊二醛溶液中，4℃放置2 h后用蒸馏水洗去多余的戊二醛，将壳聚糖小球4℃条件下保存于蒸馏水中备用。

蔗糖异构酶的固定化：称取5.0 g湿壳聚糖微球，加入10 mL含一定单位酶活的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（50 mmol/L，pH 6.0），于 4 ℃振荡吸附交联一定时间后取出抽滤，用蒸馏水洗去未交联游离酶，即得到固定化酶。

采用单因素实验分别研究壳聚糖质量浓度（2、3、4、5 g/dL）、戊二醛加量（体积分数）（0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、2.0%、3.0%）、酶加量（30、50、70、100、200 U/g）和固定化时间（4、6、12、16、20、24 h）对固定化效果的影响。

1.2.3 酶活力测定 将900 μL含有蔗糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（50 mmol/L，pH 6.0）加入到1.5 mL的EP管中，加入100 μL适当稀释的酶液，使得蔗糖的终质量浓度为100 g/L。将混合液振荡混匀，置30℃的水浴中反应15 min，高温灭酶，离心取上清。利用HPLC检测反应样品中异麦芽酮糖的含量。

酶活力单位定义：上述反应条件下，每分钟释放1 μmol异麦芽酮糖所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

固定化酶活力的测定只需要将100 μL适当稀释的酶用一定质量的固定化酶代替，其他步骤相同。固定化酶活收率计算公式如下：

式（1）中，R为固定化酶活回收率；K0为加入游离酶总活力；K1为固定化酶总活力。

1.2.4 固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖工艺优化

1）温度对固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的影响。用pH 6.0的磷酸缓冲液溶解400 g/L的蔗糖作为底物，固定化酶加量为20 U/g，反应初始pH 6.0， 分别置于 20、25、30、35、40、45、50 ℃水浴恒温振荡器中，150 r/min，转化12 h。HPLC检测，计算产物得率。

2）pH值对固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的影响。分别用 pH 值为 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的磷酸缓冲液配制400 g/L的蔗糖作为底物，固定化酶加量为20 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒温振荡器，转化12 h。HPLC检测，计算产物得率。

3）加酶量对固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的影响。以pH 4.5的400 g/L的蔗糖作为底物，固定化酶加量分别为 5、10、15、20、25 U/g 和 30 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒温振荡器中，转化12 h。HPLC检测，计算产物得率。

4）底物质量浓度对固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的影响。分别配制pH 4.5的 200、300、400、500、600、700 g/L 和 800 g/L 的蔗糖溶液，固定化酶加量为15 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒温振荡器中，转化12 h。HPLC检测，计算产物得率。

5）反应时间对固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的影响。以pH 4.5的400 g/L的蔗糖作为底物，加酶量为15 U/g，置于30℃、转速为150 r/min的水浴恒温振荡器中，每隔一定时间取样500 μL。HPLC检测，计算产物得率。

1.2.5 HPLC检测法计算异麦芽酮糖产物得率 转化后的样品灭酶后离心，取上清适当稀释，过滤后备用。HPLC检测条件参考程胜等[17-18]的方法：流动相为体积分数80%的乙腈，超声脱气20 min，流速为0.8 mL/min；柱温 30℃。

式（2）中，I为异麦芽酮糖产物得率；A1为样品峰面积；C为标样浓度；V为样品体积；k为样品稀释倍数；A0为标样峰面积；m为底物蔗糖质量。

1.2.6 固定化酶的操作稳定性研究 以pH 4.5的600 g/L的蔗糖溶液为底物，固定化酶加量为15 U/g，置于30℃、150 r/min的水浴恒温振荡器中，转化10 h后将反应液移出，用磷酸缓冲液（pH 4.5）淋洗固定化酶至检测不出糖，加入底物进行新一批的反应，连续转化16批。用HPLC检测每批异麦芽酮糖生成量，计算各批次产物得率及固定化酶的残余酶活，考察固定化酶的重复使用稳定性。

2 结果与讨论

2.1 蔗糖异构酶游离酶的制备

SDS-PAGE电泳如图2，在大约65×103处即为目的蛋白条带。

图2 蔗糖异构酶SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the sucrose isomerase

2.2 蔗糖异构酶固定化方法的优化

2.2.1 壳聚糖质量浓度对固定化酶活回收率的影响 在戊二醛加量为1%、加酶量为50 U/g、固定化时间为12 h的条件下研究不同壳聚糖浓度对固定化蔗糖异构酶酶活回收率的影响，结果见图3。

由图3可知，于3 g/dL的壳聚糖质量浓度下酶活力回收率达到最大值为53.8%。在实验过程中发现，壳聚糖浓度大小会影响溶液的密度和黏度，当壳聚糖质量浓度为1 g/dL时，制得的壳聚糖溶液黏度低。随着壳聚糖质量浓度的增加，酶活力和酶活力回收率均达到较好的效果。壳聚糖的质量浓度继续增大则浓度过高，粘结成块，这一现象与汤卫华等[19]的研究结果一致。因此选择壳聚糖的质量浓度为3 g/dL。

图3 壳聚糖质量浓度对固定化蔗糖异构酶活力回收率的影响Fig.3 Effect of chitosan conversation on recovery of immobilized enzyme

2.2.2 戊二醛加量对固定化酶活回收率的影响在壳聚糖质量浓度为3.0 g/dL、加酶量为50 U/g、固定化时间为12 h的条件下研究戊二醛加量对固定化蔗糖异构酶酶活回收率的影响，结果见图4。

图4 戊二醛加量对固定化蔗糖异构酶活力回收率的影响Fig.4 Effect of glutaraldehyde concentration on recovery of immobilized enzyme

由图4可知，酶活力回收率与戊二醛含量呈倒U型关系。戊二醛不仅是固定化酶反应的交联剂，同时可使酶变性。戊二醛加量增多，壳聚糖微球内的游离醛基数则随之增多，但过量的戊二醛基会导致酶失活。当戊二醛加量为0.75%时，酶活回收率达到最大值55.6%。因此，选择固定化酶的最适戊二醛加量为0.75%。

2.2.3 游离酶加量对固定化酶活回收率的影响 在壳聚糖质量浓度为3.0 g/dL、戊二醛加量为0.75%、固定化时间为12 h的条件下研究不同酶加量对固定化蔗糖异构酶酶活回收率的影响，结果见图5。

图5 游离酶加量对固定化蔗糖异构酶活力回收率的影响Fig.5 Effect of free enzyme concentration on activity and recovery of immobilized enzyme

由图5可以看出，当加酶量为50 U/g时，酶活达到最大为27.6 U/g，继续加大酶加量则固定化酶的活力增加不显著。这可能和载体与酶的固定化作用方式有关。在酶加量与固定化上的游离醛基数量未达到平衡时，固定化酶的酶活随给酶量的增加而增大，但当载体上的醛基与酶作用达到饱和之后继续加大酶加量，酶活不会再增加，相应的酶活力回收率逐渐降低。综合考虑酶制剂的成本、酶活和酶活力回收率，选择加酶量为50 U/g。

2.2.4 固定化时间对固定化酶活回收率的影响在壳聚糖质量浓度为3.0 g/dL、戊二醛加量为0.75%、加酶量为50 U/g的条件下，研究固定化时间对固定化蔗糖异构酶酶活力回收率的影响，结果见图6。

图6 固定化时间对固定化蔗糖异构酶活力回收率的影响Fig.6 Effect of immobilization time on activity and recovery of immobilized enzyme

由图6可以看出，当固定化时间达到16 h后，载体与酶的作用达到饱和，此时酶活力回收率达到70.3%，酶活为 35.2 U/g，酶固载量为 0.04 mg/g，因此选择的固定化时间是16 h。

2.3 固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖工艺优化

2.3.1 温度对固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的影响 如图7所示，30℃时，异麦芽酮糖产物得率达到最大值83.4%。温度升高或降低，产物得率均呈下降趋势。这与蔗糖异构酶同时具有水解与异构活性有关。实验过程中发现，高温可能有利于蔗糖的水解反应，酶转化体系中单糖含量会随着温度的升高而增加。而低温虽然有利于异构化，但此时酶的构象更利于生成海藻酮糖。这与ZHANG等[20]研究Klebsiellasp.LX3蔗糖异构酶的发现一致。综合以上因素，以30℃为后续研究的反应温度。

图7 温度对异麦芽酮糖产物得率的影响Fig.7 Effect of temperature on the yield of isomaltulose

2.3.2 初始pH对固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的影响 见图8，当初始pH为4.5时，异麦芽酮糖产物得率最高，达到84.8%。推测pH可能影响酶活性部位有关基团的解离状态，高于或低于最适pH值时，酶处于不利于催化的解离状态。因此以4.5为最适pH。

图8 初始pH对异麦芽酮糖产物得率的影响Fig.8 Effect of initial pH on the yield of isomaltulose

2.3.3 底物质量浓度对固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的影响 见图9，底物质量浓度为500 g/L时，产物得率达87.9%。而以500～700 g/L蔗糖为底物时，虽然转化率基本保持恒定，但考虑到高质量浓度的蔗糖时体系水活力较低，后续以质量浓度600 g/L的蔗糖进行试验。

图9 底物质量浓度对异麦芽酮糖产物得率的影响Fig.9 Effect of sucrose concentrations on the yield of isomaltulose

2.3.4 固定酶用量对固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的影响 见图10，异麦芽酮糖转化率随着酶加量的增加而升高，当酶用量为15 U/g时，产物得率达到最大85.2%。但随着酶用量的继续增加，异麦芽酮糖转化率稍微降低。故而以15 U/g为最优酶加量。

图10 加酶量对异麦芽酮糖产物得率的影响Fig.10 Effect of enzyme concentration on the yield of isomaltulose

2.3.5 反应时间对固定化蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的影响 见图11，在转化10 h时转化率达到最大值87.8%，10 h后转化率基本不变。因此，最佳转化时间可以选择为10 h。

图11 反应时间对异麦芽酮糖产物得率的影响Fig.11 Effect of reaction time on the yield of isomaltulose

2.4 固定化酶的操作稳定性研究

图12为固定化酶连续转化16次的产物得率与残余酶活。固定化酶连续转化10次，酶活保留率超过50%；连续转化16次，产物得率仍有87.52%，显示该固定化酶具有较好的操作稳定性及较高的异麦芽酮糖合成能力。

图12 固定化酶的操作稳定性Fig.12 Operational stability of immobilized enzyme

3 结语

本研究以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂，采用吸附交联法对重组工程菌来源的蔗糖异构酶进行固定化。结果表明，最佳固定化条件：壳聚糖质量浓度3 g/dL、戊二醛加量0.75%、酶加量 50 U/g、固定化时间16 h，此时固定化酶活力回收率达到70.3%。重组酶制备异麦芽酮糖的最佳转化条件：温度 30 ℃、初始pH 4.5、酶用量 15 U/g，转化 10 h，蔗糖质量浓度600 g/L，异麦芽酮糖最大产物得率可以达到87.8%。在最佳的转化条件下连续转化16次，产物得率无明显降低，显示该固定化酶具有良好的操作稳定性及较高的异麦芽酮糖合成能力，为固定化酶法合成异麦芽酮糖的工业化提供了一定的参考价值。