高效液相色谱法测定经酸水解后莲房中槲皮素的含量

肖建平 ，李 彧 ，曾荣洁 ，林 超 ，陈建忠

（1.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003；2.福建省康复技术重点实验室，福建 福州 350003；3.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

莲房为睡莲科多年水生草本植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥成熟花托，是莲子生产过程中的副产物，同时也是一味药用部位独特的中药，主产于福建、湖南、湖北、江苏、浙江等地。根据2015年版《中国药典》记载，莲房炭（莲房的炮制品）味苦、涩，性温，归肝经，用于崩漏、尿血、痔疮出血、产后瘀阻、恶露不尽等［1-4］。药理研究表明，莲房具有较明显的抗氧化作用［5-6］，也可配伍用于治疗母儿ABO血型不合溶血病［7-8］。目前2015年版《中国药典》一部中对莲房的检测项目仅有药材性状鉴别、粉末显微鉴定、水分和灰分的要求，整体过于简单，不能满足莲房质量控制的要求。莲房中主要含有黄酮类和多酚类活性成分，其中黄酮类有金丝桃苷、槲皮素等，多酚类成分有原花青素等。这些成分大都与莲房的许多保健和治疗作用密切相关［9-11］。但考虑到原花青素类化合物结构相对复杂、不够稳定和对照品不易获取等因素［12］，本研究根据前期的文献调研，以槲皮素为指标性成分，建立经水解的莲房中槲皮素含量的测定方法，为提升和完善莲房的质量标准提供实验数据。

1 仪器与材料

1.1 试药 槲皮素对照品（批号：100081-200603，纯度：96.5%）购自中国食品药品检定研究院，色谱纯甲醇购于默克公司，水为超纯水，其余溶剂为分析纯。15批莲房样品主要收集于福建、北京、广东等地，经鉴定为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥花托。

1.2 仪器 Alliance高效液相色谱仪 （美国Waters公司）包括Empower化学工作站、二极管阵列检测器（PDA）等；BSA系列电子分析天平（德国塞多利斯科学仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Thermo Scientific Syncronis C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.012 5%磷酸溶液（60∶40）；检测波长为 370 nm；流速为 1.0 mL／min；柱温为 30 ℃，进样量为 20 μL。在上述色谱条件下，槲皮素的保留时间为8.3 min，样品中其他成分不影响测定，见图1。理论板数按槲皮素峰计算均不低于3 000。

2.2 对照品溶液的制备 取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇-盐酸（55%，v／v）混合溶液（4∶1，v／v），制成每1 mL中含槲皮素9.866 μg的对照品溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约0.3 g，精密称定，置150 mL圆底烧瓶中，精密加入甲醇-盐酸（55%，v／v）混合溶液（4∶1，v／v）25 mL，密塞，称定重量，85℃恒温水浴加热回流3.0 h后，取出，冷水迅速冷却至室温，再称定重量，用甲醇-盐酸（55%，v／v）混合溶液（4∶1，v／v）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 检测限与定量限 以信噪比为3∶1确定槲皮素的检测限为7 ng；以信噪比为10∶1确定槲皮素的定量限为14 ng。

图1 HPLC色谱图

2.4.2 线性关系 精密称取槲皮素对照品12.33 mg，置 250 mL容量瓶中，加甲醇-55%盐酸（4∶1）的混合溶液至刻度，摇匀。精密吸取该溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL 转移至 2 mL 容量瓶中，分别加甲醇-55%盐酸溶液（4∶1）混合溶液，稀释至刻度，摇匀，制成槲皮素浓度为2.466、4.933、9.866、14.80、19.73、24.67、37.00 和 49.32 μg／mL 的对照品溶液。准确吸取上述对照品溶液20 μL，按上述确定的色谱条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，槲皮素回归方程为Y＝82 458X＋19 253，相关系数r＝0.999 8。

2.4.3 精密度试验 日内精密度：准确吸取同一供试品（收集地福建福州，产地福建）溶液20 μL，连续进样6次，测得槲皮素的峰面积RSD为1.4%。日间精密度：上述供试品溶液连续测定3 d，每日测定6次，测得槲皮的素峰面积RSD为1.9%。

2.4.4 重现性试验 取同一样品6份，精密称定，按“2.3”项下的供试品溶液制备方法操作，在上述色谱条件下进行进样测定，测得槲皮素的含量RSD为1.6%。

2.4.5 稳定性试验 准确吸取同一供试品溶液20 μL，分别在 0、4、12、24、48、72 h 进行测定，以槲皮素的峰面积进行考察，进样6次，测得槲皮素的峰面积RSD为1.5%，表明样品至少在72 h内稳定。

2.4.6 加样回收率试验 取已知槲皮素含量的莲房样品粉末0.15 g，精密称定9份，每3份加入相同量（分别为已知含量的80%、100%和120%）的槲皮素对照品，按“2.3”项下供试品溶液制备方法操作、测定。结果见表1。

表1 槲皮素的加样回收率结果（n＝9）

2.5 样品测定 按照本方法的测定条件，分别测定15批次的莲房样品，每个批次平行2份，每份样品平行进样3针，以外标法计算样品中槲皮素的含量，结果见表2。

3 讨 论

3.1 指标性成分的选择 莲房中含有多种黄酮苷和黄酮苷元成分，这些黄酮又多具有良好的药理活性。因此，对这些黄酮的含量测定是对莲房进行质量控制的有效方法。但是目前多数黄酮苷对照品还未有商品化供应，且很多苷的化学结构不稳定，故选择黄酮苷作为莲房的质量控制指标在实际应用中尚有一定的困难，而莲房水解后黄酮苷元槲皮素的含量较高，检测的稳定性较好，同时又与莲房的药理活性具有相关性，且对照品相对稳定、价廉易得，所以选择槲皮素作为莲房质量控制的指标性成分。

表2 不同批次莲房中槲皮素的含量结果（n＝2）

3.2 提取方法的选择及优化 前期预实验我们曾采取溶剂直接提取测定槲皮素的方法［13-14］，但在实验过程中发现，槲皮素的含量很低，回收率不稳定。后经文献调研，发现大多数黄酮苷类化合物口服后，首先在消化道上皮细胞水解酶或肠道微生物作用下，水解或转变成相应的黄酮苷元后再被吸收而发挥疗效，所以口服黄酮苷类化合物的效应实际为其苷元的活性［15-16］。化学成分研究表明，莲房中黄酮苷的苷元多数为槲皮素，因此本试验采用酸水解方式提取莲房后，用HPLC法测定槲皮素的含量，结果表明酸水解后槲皮素含量明显上升，并且方法的提取率高、简便、稳定、准确。

在供试品溶液制备中，我们分别考察不同酸度的提取溶剂（30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%盐酸的混合溶液）、不同提取温度（75、80、85、90、95 ℃）、不同提取时长（1.5、2.0、3.0、4.0 h）和不同提取的次数（1次和 2 次）。 结果表明，以甲醇-盐酸（55%，v／v）混合溶液（4∶1，v／v）为溶剂，在 85 ℃恒温水浴下加热水解1次，每次3.0 h，为莲房的最佳提取方法。在我们的实验过程中，还发现溶剂对槲皮素的响应值影响较大，所以配制对照品溶液时，必须使用与制备供试品溶液相同的溶剂。

3.3 耐受性实验 在耐受性实验中，分别考察3种不同品牌的 C18色谱柱、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL／min）、不同柱温（25、30、35 ℃）和不同流动相 pH 值（2.05、2.25和2.35）等，结果表明，色谱条件的微小变化对测定结果影响不大（RSD＜1%），说明本方法的耐用性好。

3.4 样品中槲皮素的含量差异 从实验结果可以看出不同批次的莲房之间槲皮素的含量差别较大，说明各地各批次的莲房品质可能有着较大的区别，这不利于中医的临床用药。因此，本文报道莲房中槲皮素的含量测定方法，简单、可靠和重现性好，可用于中药莲房的质量控制与评价研究，对于提高质量、保证临床疗效具有重要意义。同时，该结果也为《中国药典》一部中莲房的质量标准提升奠定基础。