莲房黄酮微波辅助提取工艺优化及其抗氧化性能

陈红梅，谢 翎，2

（1.安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆 246011；2.安徽农业大学微生物防治省重点实验室，安徽合肥230036）

莲（Nelumbium nuciferum）为睡莲科多年生草本植物，因具有可口的风味和较高的营养价值，深受人们喜爱，在我国广泛种植。莲有多个部位可以入药，包括荷花、荷叶、莲子、莲房、藕等，且药用价值不同[1-2]。莲房是莲的干燥成熟花托，又名莲蓬壳（lotus seed pod，LS），体轻，质疏松，味苦涩，归肝经，具有消瘀、止血、袪湿等功效[3]。经研究发现，莲房中富含多种化学成分，其中包括槲皮素、金丝桃苷、槲皮素-3-二葡萄糖苷等黄酮类化合物[4]。黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、降血脂等作用[5]，已被广泛应用于食品、卫生及化妆品行业中。目前对莲房多酚类物质研究较多，而对黄酮类化合物的研究却很少。莲房作为莲的非可食部分，一般采摘于立夏后，除少数被民间作为食物香料使用外，大部分均作为废弃物而被直接丢弃，不仅造成了极大的浪费，莲房较大的体积堆积在一起也对环境造成了严重的污染。提取黄酮类化合物最常用的方法有有机溶剂提取法、超声波辅助提取法和微波辅助提取法等，而用微波辅助提取莲房黄酮的文章几乎未见报道。本研究采用微波辅助提取法对莲房黄酮进行提取，并结合单因素实验和正交实验筛选出最佳的工艺条件。同时通过对莲房黄酮提取物的还原力、DPPH自由基清除率及羟基自由基清除率的测定，对莲房黄酮提取物抗氧化活性进行测定[6]，以期为莲房的综合利用提供理论依据，也为天然抗氧化剂的开发提供新的资源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莲房 购于农贸市场；芦丁标准品 上海生化制品厂；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH） Sigma公司；硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、铁氰化钾、三氯化铁 均为分析纯。

UV-2000型紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯公司；FA2004A型电子天平 上海精天电子仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；FW-100型高速粉碎机 上海楚定分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的制作 准确称取芦丁标准品20mg，置于50mL容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，得到质量浓度为0.4mg/mL的标准溶液。精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL标准溶液置于25mL容量瓶中，用70%乙醇补充至10mL，各加入5%的NaNO2溶液2mL，混匀，放置6min，再加入10%Al（NO3）3溶液2mL，混匀，放置6min，再各加入4%的NaOH溶液2mL，用70%乙醇定容至刻度，混匀，放置15min，在波长510nm处测定吸光度。以芦丁标准溶液的质量浓度（C：mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得到回归方程：A=0.2845C-0.2811，R2=0.9995。

1.2.2 莲房黄酮提取工艺及含量测定 准确称取莲房粉末5.0g放入磨口三角烧瓶中，加入一定体积一定浓度的乙醇溶液，在一定温度下回流提取一定时间，过滤，滤渣用石油醚脱色2次后再次过滤，所得滤渣用70%乙醇溶解并定容至50mL，作为待测液，按1.2.1进行操作，测定黄酮含量。

1.2.3 单因素实验 称取一定量的莲房粉末，以黄酮得率为考察指标，分别研究不同乙醇浓度、料液比、提取时间和微波功率对莲房黄酮得率的影响。

1.2.3.1 乙醇浓度对浸提效果的影响 称取烘干至恒重的莲房粉末5.0g，按料液比1∶10的比例分别加入质量分数为40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，在微波功率200W的条件下，提取80s，研究不同乙醇浓度对莲房黄酮得率的影响。

1.2.3.2 料液比对浸提效果的影响 称取烘干至恒重的莲房粉末5.0g，分别按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的比例加入质量分数为70%的乙醇溶液，在微波功率200W的条件下，提取80s，研究不同料液比对莲房黄酮得率的影响。

1.2.3.3 提取时间对浸提效果的影响 称取烘干至恒重的莲房粉末5.0g，按料液比1∶15的比例加入质量分数为70%的乙醇溶液，在微波功率200W的条件下，分别提取20、40、60、80、100、120、140s，研究不同提取时间对莲房黄酮得率的影响。

1.2.3.4 微波功率对浸提效果的影响 称取烘干至恒重的莲房粉末5.0g，按料液比1∶15的比例加入质量分数为70%的乙醇溶液，分别在微波功率100、200、300、400、500、600W的条件下，提取100s，研究不同微波功率对莲房黄酮得率的影响。

1.2.4 正交实验设计 在单因素实验的基础上，选择乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度四个因素，以莲房黄酮得率为指标，进行L9（34）正交实验，因素水平见表1。

表1L9（34）正交实验因素水平表Table 1Factors and levels of L9（34）orthogonal design

1.2.5 莲房黄酮提取物抗氧化性能测定

1.2.5.1 还原力的测定[7-8]分别配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL质量浓度的样品溶液，取1.0mL样品溶液置于试管中，再加入pH6.6的磷酸盐缓冲溶液1.5mL和1%铁氰化钾溶液1.5mL，充分混匀，置于50℃恒温水浴锅中保温30min，冷却后加入三氯乙酸1mL，充分振荡后，于4500r/min下离心10min。取上清液1mL加入1mL 0.1%FeCl3溶液和2mL蒸馏水混匀，静置10min，在波长700nm处测定其吸光度值，以蒸馏水为空白。吸光度值越大，样品的还原力越强。另以VC作阳性对照。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率[9-10]的测定 分别配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL质量浓度的样品溶液，取0.3mL样品溶液同2.7mL 0.1mmol/L的DPPH甲醇溶液充分混匀，在室温下反应2h后在517nm波长处测定吸光度值，未加入样品的DPPH甲醇溶液为空白。同时，以VC和BHT作阳性对照。样液对DPPH自由基的清除率按式（1）计算。

式中：A0为空白吸光度值；A1为样品溶液吸光度值。

1.2.5.3 羟基自由基（·OH）清除率[11-12]的测定 分别配制0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL质量浓度的样品溶液，吸取1.0mL置于试管中，加入1.0mL 5mmol/L的水杨酸溶液和1.0mL 5mmol/L的FeSO4溶液，再加入2.0mL蒸馏水，充分混匀后加入1.0mL 5mmol/L的H2O2，在37℃水浴中恒温反应30min后，于510nm处测定其吸光度值，以蒸馏水作空白，同时以VC作阳性对照。样液对羟基自由基（·OH）的清除率按式（2）计算。

式中：A0为空白吸光度值；A2为加入黄酮溶液后的吸光度值；A1为不加H2O2的黄酮溶液吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对莲房黄酮得率的影响 结果见图1，由图1可以看出，随着乙醇浓度的增加，莲房黄酮得率也在增加。在乙醇浓度为70%时，黄酮得率达到最大。进一步增加乙醇浓度，黄酮得率反而下降。这主要是因为，随着乙醇浓度的增加，也增加了一些脂溶性物质的溶出度，影响了莲房黄酮得率。所以，选择质量分数为70%的乙醇溶液作为提取溶剂。

图1 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on flavonoid yield

2.1.2 料液比对莲房黄酮得率的影响 结果见图2，由图2可以看出，随着料液比的减小，莲房黄酮得率也在逐渐增加，但当料液比达到1∶20时，继续减小料液比，莲房黄酮得率增加缓慢。考虑到成本和后续操作，选择料液比为1∶15比较合适。

图2 料液比对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of material-solvent ratio on flavonoid yield

2.1.3 提取时间对莲房黄酮得率的影响 结果见图3，由图3可以看出，提取时间在由20s上升到80s这段区间，莲房黄酮得率上升也比较快；提取时间进一步升高后，黄酮得率也在增加，但增加的速率很缓慢，达到120s时，黄酮得率几乎不再增加，这主要是因为提取时间达到一定值后，莲房黄酮提取物已基本全部溶出，因此选择提取时间为100s。

图3 提取时间对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on flavonoid yield

2.1.4 微波功率对莲房黄酮得率的影响 结果见图4，由图4可以看出，当微波功率逐渐升高时，黄酮得率也呈增加趋势；当微波功率达到400W后再增加功率，黄酮得率呈缓慢下降趋势。这主要是因为，随着微波功率的升高，使得温度也升高，黄酮分子运动加速，能较快的从细胞转移至溶液中；但如果微波功率过高，也使得杂质的溶出量增多，影响黄酮的得率。

图4 微波功率对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of microwave power on flavonoid yield

2.2 正交实验结果

为综合考虑各因素相互作用对莲房黄酮得率的影响，在单因素实验的基础上进行四因素三水平的正交实验，结果如表2所示。由极差分析表明，RA＞RD＞RC＞RB，即对莲房黄酮得率影响的主次顺序依次为：乙醇浓度＞微波功率＞提取时间＞料液比。表3方差分析结果，FB＜FC＜FD＜FA＜F0.05=4.460，表明各因素对莲房黄酮得率的影响均不显著。最佳提取工艺条件为A3B2C3D2，即乙醇浓度为70%，料液比为1∶15，提取时间为100s，微波功率为350W，在此条件下，经平行实验验证（n=5），莲房黄酮得率为11.42%。

表2 正交实验设计与结果Table 2 Design and results of orthogonal experiment

表3 正交实验方差分析结果Table 3 Variance analysis results of orthogonal experiment

2.3 莲房黄酮提取物抗氧化性能研究

2.3.1 莲房黄酮提取物的还原力 反应体系中，吸光度值的变化能反映出样品还原力的高低，吸光度值越大表明样品的还原力越强[13]。由图5可知，随着莲房黄酮提取物质量溶液的升高，它的还原力也在不断增强，并且随着浓度越来越高，还原力增加的趋势也在加大。当莲房黄酮提取液质量浓度为0.3mg/mL时，它的还原力与VC的还原力相当。整体来说，莲房黄酮提取液的还原力不如VC的还原力。

图5 莲房黄酮提取液的还原力Fig.5 Total reduction of flavonoid

2.3.2 莲房黄酮提取物对DPPH自由基的清除率 由图6可知，莲房黄酮提取液质量浓度由0.05mg/mL增加至0.3mg/mL时，它对DPPH·的清除率增加也较快；随着浓度的进一步升高，对DPPH·的清除率也在增大，但此时增长速率较慢。对照品VC和BHT对DPPH·的清除率也均随着质量浓度的增加而增大。黄酮提取液对DPPH·的清除率与VC相比，不如VC对DPPH·的清除效果明显。与BHT相比，当黄酮提取液质量浓度比较小时，对DPPH·的清除率不如BHT；但当黄酮提取液质量浓度达到0.3mg/mL后，它对DPPH·的清除率与BHT对DPPH·的清除率相当。

图6 莲房黄酮提取液对DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging activity of flavonoid on the DPPH free radical

图7 莲房黄酮提取液对羟基自由基的清除作用Fig.7 Scavenging activity of flavonoid on the hydroxyl free radical

2.3.3 莲房黄酮提取物对羟基自由基清除率 由图7可以看出，莲房黄酮提取液具有一定的清除羟基自由基的作用，随着黄酮提取液质量浓度的增加，对羟基自由基的清除率也在增强。对照品VC对羟基自由基的清除率也随着其质量浓度的增加而升高，在质量浓度较低时，莲房黄酮提取液清除羟基自由基的效果不如VC，但当质量浓度达到0.3mg/mL时，发现莲房黄酮提取液对羟基自由基的清除能力大于VC的清除能力。

3 结论

研究了微波辅助提取莲房黄酮的工艺，结果表明影响莲房黄酮得率的主要因素是乙醇浓度，其次是微波功率和提取时间，料液比的影响最小。经正交实验优化后的工艺参数为：乙醇浓度为70%，料液比为1∶15，提取时间为100s，微波功率为350W，在此条件下，莲房黄酮得率为11.42%。微波辅助提取法可以通过高能作用促进目的物从溶质中的溶出，具有高效、操作简单、用时短、产率高、杂物少等特点，有利于莲房黄酮的提取，可以成为提取莲房黄酮的首选方法之一。

样品抗氧化性能评价方法有很多种，还原力与抗氧化能力存在密切的关系，还原力越强，表现出的抗氧化能力也就越强[14-15]。DPPH自由基因为操作简便、快速，广泛应用于抗氧化活性评价。羟基自由基在生物体内对机体的危害很大，是较强的氧化剂。抗氧化实验表明，莲房黄酮提取物具有较强的还原力，还原力随着黄酮提取物质量浓度的增加而增强。莲房黄酮提取物对DPPH自由基和羟基自由基均有一定的清除率，但清除效果不一样。莲房黄酮提取物对DPPH自由基的清除能力不如同质量浓度的BHT和VC，但莲房黄酮提取物对羟基自由基的清除能力与同质量浓度的VC相当，甚至在质量浓度较高时，超过VC。这可能是因为莲房黄酮提取物对不同的自由基表现的敏感性不同。总的来说，莲房黄酮提取物具有较强的抗氧化活性，可以作为天然氧化剂的潜在来源。

[1]SRIDHAR KR，BHAT R.Lotus：a potential nutracoutical source[J].Journal of Agricultural Technology，2007，3（1）：143-155.

[2]MUKHERJEE PK，DAS J，SAHA K，et al.Diuretic activity of extract of therhizomes of Nelumbo nucifera Gaertn[J].Phytotherapy Research，1996（10）：424-425.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：257.

[4]国家中医药管理局.中华本草[M].第八卷.上海：上海科学技术出版社，1999：405，333.

[5]STANISLAW Burda，WIESLAW Oleszek.Antioxident and antiradical activities of flavonoids[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49（6）：2774-2779.

[6]MAYACHIEW P，DEVAHASTIN S.Antimicrobial and antioxidant activities of Indian gooseberry and galangal extracts[J].LWT-Food Science and Technology，2008，41（7）：1153-1159.

[7]APATI P，SZENTMIHALYI K，KRISTO S T，et al.Herbal remedies of Solidago-correlation of phytochemical characteristics and antioxidantproperties[J].JournalofPharmaceutical&Biomedical Analysis，2003，32（4）：1045-1053.

[8]吕英华，苏平，那宇，等.桑椹色素体外抗氧化能力研究[J].浙江大学学报，2007，33（1）：102-107.

[9]朱艳华，谭军.玉米多肽抗氧化作用的研究[J].中国粮油学报，2008，23（1）：36-43.

[10]HATANO T，KAGAWA H，YASUHARA T，et al.Two new flavonoids and other constituents in licorice root：their relative astringency and scavenging effects[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin，1988，36（6）：2090-2097.

[11]莫开菊，柳对，程超.生姜黄酮的抗氧化活性研究[J].食品科学，2006，27（9）：110-115.

[12]刘玉芬，夏海涛.响应面法优化碱蒿黄酮提取工艺及其体外抗氧化作用[J].食品科学，2012，33（12）：63-68.

[13]LIU J，WANG C N，WANG Z Z，et al.The antioxidant and free-radical scavenging activities of extract and fractions from corn silk（Zea mays L.） and related flavone glycosides[J].Food Chemistry，2011，126（1）：261-269.

[14]SUN L J， ZHANG J B， LU X Y， et al.Evaluation to the antioxidant activity of total flavonoids extract from persimmon（Diospyros kaki L.） leaves[J].Food and Chemical Toxicology，2011，49（10）：2689-2696.

[15]BERTONCELJJ，DOBERSEK U，JAMNIK M，et al.Evaluation of the phenolic content，antioxidant activity and colour of Slovenian honey[J].Food Chemistry，2007，105（2）：822-828.