急性心肌梗死(AMI)发病急骤,病情进展迅速,致死率较高[1]。微小RNA(miRNA)对心肌细胞功能具有调节作用,有望成为诊断AMI的生物标志物[2]。近年来研究发现,miR-302b与心血管疾病关系密切,参与心肌损伤的发生发展,并起着重要的基因调控作用[3]。本研究通过检测老年AMI患者血清miR-302b的表达水平,分析其对AMI的诊断价值,旨在为老年AMI早期诊断提供参考依据。
选取2015年1月至2018年10月儋州市中医医院收治的老年AMI患者125例作为AMI组,其中男性79例,女性46例,年龄65~84岁,平均年龄(72.50±6.92)岁。纳入标准:(1)符合WHO心肌梗死诊断和治疗指南制定的标准[4];(2)年龄≥65岁,且在发病12 h内采集血样。排除标准:(1)有陈旧性心肌梗死、慢性心力衰竭及心功能不全病史;(2)急性心肌炎,近期有脑血管事件;(3)肺源性心脏病、慢性阻塞性肺疾病、严重肝肾功能不全及自身免疫性疾病;(4)重度感染;(5)恶性肿瘤;(6)重大外伤及手术。另选取同期健康体检者56例作为对照组,其中男性36例,女性20例,年龄65~78岁,平均年龄(71.30±6.82)岁。本研究经医院伦理委员会批准,并与所有研究对象签署知情同意书。
所有研究对象均空腹抽取静脉血5 mL,置于无抗凝剂的离心管中,离心分离血清,-80 ℃低温冰箱保存待测。应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription试剂盒逆转录已定量的RNA,选用 U6 作为内参,反应体系为 15 μL,反应参数为:16 ℃ 30 min;42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 min。在ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时聚合酶链反应(RT-PCR)。采用TaqMan MicroRNA Assay试剂盒,反应体系为20 μL:TaqMan MicroRNA Assay 1.00 μL,cDNA 1.33 μL,TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μL,ddH2O 7.67 μL,混合后离心放入定量 PCR仪。扩增条件为:95 ℃预热10 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火60 s,45个循环,最后38 ℃延伸5 s,实验重复3次。以U6为内参照,采用2-△△Ct法计算miRNA的相对表达水平,其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。
心肌肌钙蛋白I(cTnI)采用贝克曼DXI800型全自动免疫分析仪通过化学发光法检测;总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平检测采用贝克曼AU5800型全自动生化分析仪及配套试剂,操作严格按照仪器及试剂说明书进行。
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差表示,组间比较采用t检验。计数资料以百分率(%)表示,组间比较采用卡方检验。绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析miR-302b、cTnI及CK-MB对老年AMI诊断的价值,曲线下面积(AUC)的比较采用Z检验。相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
AMI组与对照组的性别、年龄、体质量指数、收缩压、舒张压、吸烟史、高血压史、糖尿病史、高脂血症、TC、TG、LDL-C及HDL-C的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。
AMI组血清miR-302b、cTnI及CK-MB水平均明显高于对照组(P均<0.01)。见表2。
表1 AMI组与对照组临床一般资料比较
表2 AMI组与对照组血清miR-302b、cTnI及CK-MB水平比较
miR-302b、cTnI及CK-MB诊断AMI的临界值分别为2.68、1.50 ng/mL、60.74 U/L。3项联合诊断老年AMI的AUC为0.932(95%CI:0.870~0.981),明显高于单项miR-302b(AUC=0.873,95%CI:0.811~0.930)、cTnI(AUC=0.887,95%CI:0.826~0.950)或CK-MB(AUC=0.718,95%CI:0.661~0.776),差异有统计学意义(Z=4.862、4.537、7.250,P均<0.05),其敏感度和特异度分别为94.5%和89.0%。miR-302b及cTnI诊断老年AMI的AUC相当,而且均明显高于CK-MB,差异有统计学意义(Z=5.617、5.912,P均<0.05)。见表3、图1。
表3 miR-302b、cTnI、CK-MB诊断老年AMI的价值
图1 miR-302b、cTnI、CK-MB诊断老年AMI的ROC曲线
Pearson相关分析显示,老年AMI患者血清miR-302b表达水平与cTnI(r=0.817)、CK-MB(r=0.726)均呈正相关(P均<0.01)。
AMI是老年人常见的急危重症,目前cTnI、CK-MB等传统心肌损伤标志物在AMI的诊疗中发挥着重要作用,但这些标志物诊断老年AMI的敏感度和特异度不高[5]。Eggers等[6]研究证实,cTnI在多种疾病治疗过程中可明显升高,在AMI早期诊断中存在一定缺陷。因此,有必要研究新型心肌损伤标志物,以期为AMI的早期诊断、早期治疗提供有利的佐证。miRNA是可在转录水平调控基因表达的小分子非编码RNA,参与心肌和血管平滑肌细胞的信号转导,并与心肌梗死、心律失常、心肌病和血管增生等疾病的病理生理有关[7]。近期研究表明,miRNA在细胞增殖、分化、发育及死亡过程中发挥重要作用,有可能成为诊断心肌病变的新型生物标志物,这也为研究AMI发生机制提供了新的思路[8]。cTnI是心肌特有的结构蛋白,对心肌损伤有高度敏感性和特异性,是欧洲和美国指南中诊断AMI的首选生物标志物。当AMI患者的心肌发生坏死时,cTnI才会释放到血液中,而miRNA可以稳定存在于血液中,且比cTnI更早释放入血液。CK-MB是一种与心肌梗死密切相关的酶类,也是临床上诊断AMI的常用指标,但其预测早期AMI的效能欠佳[9]。
本研究结果显示,AMI组血清miR-302b、cTnI及CK-MB水平均明显高于对照组,提示血清miR-302b在老年AMI患者中高表达,可能参与AMI的发生发展。陈劲松等[10]对73例AMI患者、49例不稳定性心绞痛患者和29名健康老人血清miRNA进行分析,结果显示老年AMI患者miRNA的表达水平明显升高,高表达miRNA可能与心肌损伤或坏死有关。Guo等[11]研究发现,AMI患者外周血中的miRNA表达水平显著升高,与cTnI、CK-MB均呈正相关,而且miRNA达峰时间早于cTnI及CK-MB,可作为AMI早期诊断的生物标志物。本研究应用ROC曲线分析,结果显示miR-302b及cTnI诊断老年AMI的AUC相当,而且均明显高于CK-MB,3项联合诊断老年AMI的AUC(0.932,95%CI:0.870~0.981)最大,其敏感度和特异度分别为94.5%和89.0%,提示miR-302b与cTnI和CK-MB 联合检测有助于提高老年AMI诊断的准确性。相关性分析也显示,老年AMI患者血清miR-302b表达水平与cTnI、CK-MB均呈正相关。Yang等[12]的研究也表明,血清miR-302b是诊断AMI的新型生物标志物,在未来有广阔的应用前景。
综上所述,血清miR-302b在老年AMI患者中明显升高,其诊断老年AMI的效能与cTnI相当,可作为诊断老年AMI的生物标志物。miR-302b与cTnI、CK-MB联合检测有助于提高老年AMI诊断的敏感度和特异度,但目前缺乏大样本临床随访研究支持,miRNA的分析技术与结果判断标准也不统一,还需进一步验证miR-302b的临床应用价值。