UPLC-MS/MS法测定蜂蜜中4种喹诺酮类药物残留

□ 谭顺中 程 燕 谭美龄 重庆市万州食品药品检验所

蜂蜜是蜜蜂从开花植物的花中采得的花蜜在蜂巢中经过充分酿造而成的天然甜物质，具有丰富的营养价值和较高的药用价值。喹诺酮类药物为人工合成的一类广谱抗菌药，具有抗菌谱广、价格低、无交叉耐药性等优点，不仅在临床有着极其广泛的应用，还被广泛应用在兽药领域。由于喹诺酮类药物在预防和治疗过程中的不规范使用，许多动物源性食品常存在该类药物的残留[1]。我国农业部为保障动物产品质量安全和公共卫生安全也于2015年决定在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂。

本研究拟通过建立UPLC-MS/MS法对50批蜂蜜中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种喹诺酮类药物残留进行测定，对我国在食品动物中停止使用这4种药物以来，蜂蜜中这四种药物的残留情况进行小范围的调查研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo TSQ Quantum Access Max超高效液相色谱质谱联用仪、IKA® MS 3 digital涡 旋 振 荡 器 ，Biotage Tulbovap ® LV 氮吹浓缩仪。

洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星混合标准溶液（均为100 μg/mL）,诺氟沙星 -D5对照品（10μg/mL）；甲醇（色谱纯）、乙酸铵（优级纯）、超纯水。

1.2 方法

1.2.1 液相色谱和质谱条件

Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）。流动相：A.5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸水溶液），B.甲醇。梯度洗脱：0～2.0 min，流动相 A 为 90% 并 保 持 ，2.0～3.5 min，流动相A从90%线性变至10%，并保持至 4.5 min。6.5～6.6 min，流动相B从90%线性回至10%，并保持至10 min。流速：0.20 mL/min。进样量：5 μL。柱温：40 ℃。质谱条件见表1。

表1 质谱条件

1.2.2 样品采样

蜂蜜样品来至重庆市3个区县（万州、云阳、开州），采样环节主要为超市、小卖店、农贸市场等流通环节以及蜜蜂养殖户等生产环节，主要品种为洋槐蜜、油菜花、椴树、枣花蜜等10种蜂蜜，共计50份样品。

1.2.3 工作曲线的绘制

准确移取适量的喹诺酮混合标准溶液，用甲醇稀释并配制成标准工作溶液（1μg/mL）。用空白样品基质溶液配制浓度为1.0、5.0、10、20、50 ng/mL 的基质工作曲线，其中诺氟沙星D5内标浓度为20 ng/mL，均以内标法定量。

1.2.4 样品处理

称取2.0 g蜂蜜样品于50 mL离心 管 中 ，加 入 200 μL 1.0 μg/mL的内标溶液（诺氟沙星D5），加入10 mL 80%甲醇水溶解，振荡混匀，过prime HLB柱净化，流出液在40 ℃氮吹浓缩至近干。用1 mL 初始流动相复溶，涡旋过0.22 μm滤膜，待测。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取柱的选择

查阅相关文献，本研究选择了MCX阳离子交换固相萃取小柱、HLB、PRiME HLB三种固相萃取柱进行净化，通过加标回收比较[2]。从回收率来看，HLB固相萃取柱和PRiME HLB萃取柱的回收率差不多，而MCX阳离子交换柱的回收率偏低。从过柱过程来看，HLB固相萃取柱和MCX阳离子交换柱均存在易堵塞净化柱，速度慢，需经过活化-淋洗-洗脱等步骤，耗时较长，重现性不理想等问题。而Oasis PRiME HLB 固相小柱是在Oasis HLB 固相小柱技术基础上开发的新一代反相固相萃取柱，属于过滤性除去杂质固相小柱，可以有效地吸附样品中蛋白质和磷脂类物质，较以往HLB固相萃取柱具有更简单、更快速优势[3]。

因此本研究前处理采用PRiME HLB一步法提取和净化蜂蜜样品，前处理简单，并且基质干扰较小、灵敏度较高，能得到较为满意的效果。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围、定量限和检出限

以峰面积对对照品浓度（ng/mL）进行回归分析，在浓度范围为1.0 ng/mL～50 ng/mL，4种化合物曲线线性良好，相关系数为0.996～0.999。按S/N=3计算检出限，检出限均为：1.0 μg/kg。

图1 10 ng/mL标准溶液中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、诺氟沙星-D5 TLC图及提取离子通道质谱图

2.2.2 回收率和精密度

在经测定不含洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种喹诺酮类药物阴性样品中进行回收率和精密度试验。在阴性样品中添加低中高3个水平的标准溶液，按本方法进行实验，回收率范围为72.48%～103.22%，RSD均不大于10.0%。

2.3 实际样品的测定

应用本方法对50批蜂蜜进行了分析测定，样品种类洋槐蜜、油菜花、椴树、枣花蜜等10种蜂蜜。50批样品中均未检出洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种喹诺酮类药物[4]。

3 结论

本文建立了UPLC-MS/MS法测定蜂蜜中4种喹诺酮类药物残留，蜂蜜样品用80%甲醇水溶解，经PrimeHLB固相萃取柱净化，超高效液相电喷雾串联四级杆质谱检测，内标法定量。经方法学验证，该方法前处理简单，且基质干扰较小、灵敏度较高，能得到较为满意的结果。50批蜂蜜样品测定结果表明洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种喹诺酮类药物在本次抽检的区域控制情况良好。