遮荫和氮素添加对芒萁光合特性与抗氧化酶活性的影响

王佳佳 张明如 高 磊 金 迪 何云核

( 1. 浙江农林大学风景园林与建筑学院，浙江 杭州 311300；2. 浙江农林大学林业与生物技术学院，浙江 杭州 311300)

自然条件下植物的生长发育速率和生理代谢过程取决于生境的质量[1]。光强、气温、相对湿度和土壤水分、养分等是决定生境质量的重要生态因子。其中，光照强度直接影响植物的光合速率[2-3]；土壤氮含量限制陆生植物的生长[4-5]。一般的，植物对光强有一定的适应范围，过弱或过强的光都会伤害植物、降低光化学效率，产生光抑制等[6]。徐祥增等[7]研究发现过度遮荫会造成三七（Panax notoginseng）光合能力明显降低，高光同样会引发三七的光氧化伤害，姜英等[8]研究红锥（Castanopsis hystrix）幼苗得出强光生境对其生长及光合作用有一定负效应的结论，周忆堂等[9]研究发现重度弱光胁迫严重影响长春花（Catharanthus roseus）叶片的光合作用。植物氮素参与光合色素、光合酶等物质的组成和分配，间接影响植物光合作用[10]；同时，光强也影响叶片氮素的含量及在各组分中的分配[11]。相关研究发现施氮显著提高玉米（Zea mays）生育后期叶片叶绿素含量和氮代谢关键酶活性[12]，增施氮肥可以缓解弱光胁迫对冬小麦（Triticum aestivum）光合作用造成的不利影响[13]，然而植物的碳氮代谢相互关联[14]，只有维持氮素和光强平衡协调的供应水平，才能发挥最佳的生态耦合效应，获得植物最佳的生长状态[15]。

芒萁（Dicranopteris dichotoma）为里白科（Gleicheniaceae）芒萁属（Dicranopteris）多年生常绿蕨类植物，属于偏阳性草本植物[16-17]。有研究表明，蕨类植物芒萁气孔的形态特征对光强的降低响应更敏感，因而能够广泛分布于林缘等开阔生境[18]。芒萁被认为是亚热带低山丘陵区次生植被的“标志种”植物[19]，自然条件下生长分布于疏灌草丛、林缘以及马尾松杉木暖性针叶林下层等多种光环境，经常形成连续密布的单优草本层片[20]。与次生裸地相比，在森林植被恢复的过程中，芒萁的覆盖有助于增加土壤含氮量，有利于退化裸地生态系统的恢复[21]。然而芒萁能够定居于异质资源的多种生境，可能与其较强的生理代谢调节能力有关。因此，为了了解次生森林植被的多种光环境与土壤含氮量的变化对芒萁光合生理代谢速率的影响，芒萁调节自身的光合生理过程来适应光强与氮素的联合变化，本研究模拟强、中和弱光环境，并进行氮素添加与否的处理，探究光强和氮素添加与否对芒萁光合参数和抗氧化保护酶活性所产生的生态影响。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2018年5月4日至9月30在浙江农林大学东湖校区（119°42′E，30°14′N）进行，芒萁采自浙江省杭州市临安区玲珑山（119°43′35″E，30°15′28″N）。试验采用盆栽法，选择芒萁克隆分株苗1株并保留10 cm左右的根状茎，栽植于40 cm×21 cm×17 cm的长方形花盆内，盆栽基质为V（芒萁地段表土）∶V（泥炭土）∶V（珍珠岩）=8∶1∶1混匀而成，将栽植的芒萁放置在3层遮荫大棚缓苗15 d。

1.2 试验方法

于2018年5月20日选择长势良好且形态基本一致的盆栽芒萁随机分成6组，每组10盆，分别放置于3个遮荫棚内，每个棚内2组，分别进行施氮（N1）和不施氮处理（N0）。遮荫棚分别为覆盖 1层（L1）、2层（L2）、3层（L3）黑色尼龙遮阳网，选择3个晴天的8：00—18：00利用DRM-FQ光量子仪（Apogee Instruments，美国）测定3个遮荫棚内的光量子通量密度，每个棚选择3个测定点，每个点测定10组数据，求取平均值，计算得到与全光相比透光率分别为35.96%、13.00%、4.75%。施氮量根据前人的研究[22]，综合调整本研究盆栽氮素所需量，每盆施0.6 g纯氮，即3 g（NH4）2SO4分析纯溶解于200 mL纯水中，均匀喷入盆内土壤表面，未施氮组喷入等量的水。生长期间适当浇水以保证芒萁不受干旱影响。

1.3 测定方法

1.3.1 光响应进程的测定

利用Li-6800便携式光合作用测定系统（Li-COR，美国）测定光合气体交换参数及光响应进程。选择晴天上午8：00—11：00，于2018年7月29日开始测定，每组处理选取3盆，每盆重复测定3次，选择成熟的功能叶片进行测定，取平均值。测定选择仪器自带的红蓝光源叶室，叶室温度设定为（25±0.5）℃；CO2浓度设置为 400 μmol/mol，气体流速为500 μmol/s，光强梯度即光合有效辐射（PAR）为 2 000、1 500、1 200、1 000、800、500、300、100、50、30、 10、 0 μmol/（ m2·s），测定净光合速率（Pn）；利用光响应测定数据进行芒萁气体交换特征，包括蒸腾速率（E）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci），借助直角双曲线修正模型[23]拟合光响应模型，根据模型计算最大净光合速率（Pnmax）、光饱和点（LSP）、光补偿点（LCP）、表观量子效率（AQY）和暗呼吸速率（Rd）。

1.3.2 丙二醛及保护性酶活性的测定

采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量；紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性；愈创木酚比色法测定过氧化物酶（POD）活性；采用SOD试剂盒测定超氧化物歧化酶（SOD）活性[24]。

1.4 数据分析

采用Excel 2003和SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。采用单因素和LSD法进行方差分析和多重比较,得到不同处理下各参数的平均值、标准误及在P=0.05水平上的差异显著性；采用双因素方差分析检验光强、氮素及其交互作用对光响应特征参数和抗氧化酶活性的影响。利用Origin Pro 8.0软件对光响应参数进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同遮荫与氮素添加对芒萁光响应特征的影响

2.1.1 不同遮荫与氮素添加光响应曲线的变化

由图1 可知，当 PAR＜100 μmol/（m2·s）时，芒萁Pn呈线性增加，各处理下芒萁Pn均非常接近。当 PAR 增加至 500 μmol/（m2·s）时，各处理组芒萁Pn增加缓慢。在未施氮组各遮荫条件下，芒萁在 PAR=500 μmol/（m2·s）时Pn出现显著性差异（P＜0.05）；而施氮组各遮荫条件下芒萁叶片Pn在 PAR=300 μmol/（m2·s）时出现显著性差异（P＜0.05）。当 PAR＞500 μmol/（m2·s）时，除 L3外，L1、L2的Pn均随PAR的增加至饱和点后出现下降趋势。由此说明，PAR达到饱和后，L1、L2叶片光合作用出现光抑制现象。L1、L2下施氮处理与未施氮处理大小变化均为N1＞N0，L3条件下施氮处理与未施氮处理大小变化表现为N1＜N0。

图1 不同遮荫和氮素添加芒萁光合作用-光响应曲线的变化Fig. 1 Changes in photosynthesis-photoresponse curves of D. dichotoma under different shades and nitrogen additions

2.1.2 不同遮荫和氮素添加对E和Gs的影响

由图1可知，各处理的E在 PAR=0 μmol/（m2·s）时表现明显的大小差异。PAR＞0 μmol/（m2·s）时，随PAR的增加E上升。E随遮荫程度的增加大小表现为L2＞L1＞L3。施氮处理后各遮荫条件下E均下降，但随PAR的增加而增加，且L1、L2极为相近。Gs随PAR变化复杂，各遮荫处理下Gs均上升缓慢且变化不一。PAR＜100 μmol/（m2·s）时，未施氮处理组，L1的Gs随 PAR 的增加而增加，PAR＞100 μmol/（m2·s）时，Gs几乎不增加且趋于稳定；L2的Gs随PAR的增加而缓慢增加，至 PAR=1 500 μmol/（m2·s）后出现略微下降；L3的Gs随PAR的增加先上升，至 100 μmol/（m2·s）后呈下降趋势。施氮处理组与未施氮处理组相比，各光强处理下芒萁叶片Gs均下降，且L2下Gs下降幅度小于L1、L3。L1遮荫条件下施氮处理组与未施氮处理组相比下降幅度为4.6%～25.0%，L2降低幅度为0.4%～4.0%，L3降低幅度为26.6%～40.8%。

图1 不同遮荫和氮素添加对芒萁E和Gs的光响应变化Fig. 2 Photoresponse changes of transpiration rate and stomatal conductance of D. dichotoma under different shades and nitrogen additions

2.1.3 不同遮荫和氮素添加对Ci的影响

由图3 可知，当 PAR＜100 μmol/（m2·s）时，不同遮荫条件下芒萁Ci下降迅速，而后下降缓慢。与光合—光响应变化相似，前期光合速率迅速上升，表现为Ci消耗增加即Ci迅速下降，而后趋于稳定，Ci下降变缓。施氮处理后，各光强下Ci的大小差异明显，且 PAR＜500 μmol/（m2·s）时，Ci的下降较快，说明氮素的输入对芒萁利用CO2的能力有一定影响，最明显的是对弱光下CO2的利用速率。施氮处理后L1、L3的Ci下降，L2的Ci上升。

图3 不同遮荫和氮素添加芒萁胞间CO2浓度的光响应变化Fig. 3 Photoresponse changes of intercellular CO2 concentration of D. dichotoma under different shades and nitrogen additions

2.2 光强和氮素添加对芒萁叶片光合-光响应特征参数的影响

由表1可知，随遮荫的增加芒萁叶片Pnmax和LSP均表现为先升后降，且均在L2下出现最大值，L3下出现最小值。随遮荫程度增加LCP下降，AQY增加且显著高于L1、L2（P＜0.05）。芒萁Rd差异不显著，L3下均出现最小值。施氮处理后，L1、L2下芒萁Pnmax增加了13.9%、11.0%，LSP分别增加了12.2%、8.2%，L3下Pnmax和LSP分别下降了17.1%、12.6%，各遮荫条件下芒萁LCP均有所下降但差异不显著，AQY均有所上升，L1、L3下芒萁Rd下降，L2上升但差异不显著。未施氮处理组，L1、L2、L3下光能利用范围分别为22.4～1 078.8、19.2～1 138.7、13.1～950.3 μmol/（m2·s），施氮处理组光能利用范围分别为19.8～1 210.2、19.1～1 232.6、8.0～830.6 μmol/（m2·s），施氮组L1、L2下芒萁光能利用范围增加了12.7%、8.4%，L3下芒萁光能利用范围下降了12.2%。

表1 不同遮荫和氮素添加与否芒萁光合光响应特征参数的变化Table 1 Changes in photosynthetic response parameters of D. dichotoma under different shades and nitrogen additions

由表2可知，遮荫对Pnmax、LSP、LCP、AQY均具有极显著性影响（P＜0.01），氮素对各光合特征参数均无显著性影响，仅LSP受到遮荫和氮素的交互显著影响（P＜0.01）。由此说明，氮素的施加可缓解遮荫对芒萁光合特征参数的影响。

表2 光强、氮素及其交互作用对芒萁光合特征参数影响的效应分析Table 2 Effect of light intensity, nitrogen and their interaction on photosynthetic parameters of D. dichotoma

2.3 遮荫和氮素添加对MDA含量和保护酶活性的影响

由表3可知，未施氮处理组，随遮荫的增加，L3下 MDA 含量显著高于 L1、L2（P＜0.05）。SOD活性随光强的降低表现为先升后降，且各遮荫条件下SOD活性差异显著（P＜0.05）。CAT活性随光强的降低而增加，表现为L3显著高于L1、L2（P＜0.05）。POD 活性随光强的减弱表现为先降后升且L3显著高于L1、L2（P＜0.05）。施氮处理组，L1下MDA含量显著下降（P＜0.05），SOD、CAT、POD活性上升。L2下MDA含量、SOD活性、CAT活性、POD活性均显著上升（P＜0.05）。L3下MDA含量下降但差异不显著，SOD活性、CAT活性、POD活性均显著降低（P＜0.05），与未施氮相比分别下降了1%、9%、21.2%、60.3%。

表3 不同遮荫和氮素添加对芒萁MDA和保护酶活性的影响Table 3 Changes of malondialdehyde and protective enzyme activities of D. dichotoma under different shades and nitrogen additions

由表4可知，遮荫、氮素及其交互作用对芒萁MDA含量和抗氧化酶活性均有极显著性影响（P＜0.01），从F值判断，氮素的添加可以降低MDA含量，SOD活性也降低，但CAT和POD活性均得到提高。

表4 光强、氮素及其交互作用对芒萁MDA和抗氧化酶活性影响的效应分析Table 4 Effect of light intensity, nitrogen and their interaction on the activity of malondialdehyde and antioxidant enzymes

3 结论与讨论

光照强度和氮素营养是植物生长发育的重要限制因子。本研究中除Rd外，其他光合特征参数均受光强的极显著性影响，氮素对其影响均不显著，表明芒萁的生长受光强的影响比氮素营养大，这与De Pinheiro等[25]对莴苣（Lactuca sativa）的研究结果相似。植物长期适应不同光环境，产生一定的适应对策，形成喜阴或喜光特性[26]。Pnmax反映植物潜在的光合能力，Pnmax越大说明植物光合能力越强[27]。本研究中，芒萁在L2遮荫下具有强的光合作用能力和较宽的光能利用范围，L2遮荫且施氮条件下对光的可利用范围达到最大程度。L3遮荫条件下芒萁显著降低LCP以提高对弱光的利用能力来适应弱光环境，又表现出一定的耐荫性。氮素参与植物光合酶的合成过程与活性的维持，从而调节光合速率[28]，表观量子效率AQY越大对弱光的利用能力越强，施氮组芒萁对弱光的利用能力均得到增强，即LCP降低、AQY增加。前人研究证明，合理施氮能提高植物的光合速率[29-32]，而生理可塑性强的植物在遮荫环境下可通过降低LCP和LSP增强对弱光的利用能力[33-35]，施氮在一定程度上增大了L1、L2下芒萁对光强的利用范围，同时增强了L3下芒萁对弱光环境的适应性。施氮降低了L3下芒萁的Pnmax，但同时Rd显著降低，说明芒萁减少了因呼吸造成的碳消耗，以提高光合产物的积累，维持正常的生长发育。有研究发现，蕨类植物在较高光强下比低光强下具有更高的光饱和点和光合作用能力[36]，本研究也证明了这一点。

植物对外界环境快速而灵敏的调控反应主要借助气孔的调节来实现，通过气孔为植物提供光合作用原料[37]。研究表明，开阔生境下芒萁气孔密度较大，气孔长度小，小而密的气孔可以使植物获得更大的气孔导度和光合速率[18]。本研究在未施氮处理组L3下，Gs随光合有效辐射增加呈现先增加后下降，可能是芒萁适应了强度遮荫环境，形成了不同的气孔形态、获得了小的气孔导度，结果无法适应较大光合有效辐射，因而最终出现Gs下降。施氮处理组随光合有效辐射增大芒萁Gs呈现缓慢的增加，气孔平稳的进行气体交换，有利于光合作用的进行，说明施氮对维持各光强下芒萁稳定的光合作用能力有一定的促进作用。通常植物光合速率的下降原因分为气孔限制和非气孔限制[37-39]。植物处于逆境时，Pn、Gs和Ci同时降低，则是由气孔限制引起，否则为非气孔限制，即光合速率的下降由植物叶肉细胞羧化能力的降低所引起。本研究结果显示，L3下Pn的降低伴随着Ci和Gs的下降，说明该环境下Pn的降低由气孔限制引起。

在正常情况下，植物体内活性氧（ROS）的产生和清除处于动态平衡状态。当遭受逆境胁迫时，植物体内的活性氧积累。为了减轻由于活性氧自由基引发的膜质过氧化伤害，植物将启动体内的保护酶系统[40]。一般的，MDA含量是判断植物细胞受伤害程度的指标，MDA含量、SOD活性、POD活性和CAT活性同时上升，或者MDA含量下降、SOD活性、POD活性、CAT活性均上升，有利于植物缓解ROS的危害，维持植物正常的生理水平[41]。本研究中，遮荫、氮素及其交互作用对MDA含量均有极显著性影响，遮荫和氮素的交互作用影响程度小于遮荫，说明氮素营养的输入一定程度上可降低芒萁受光胁迫的伤害。芒萁在L3下MDA含量显著高于L1、L2，说明其受膜质过氧化伤害最严重，但其启动保护酶系统，提高SOD、CAT、POD活性，以歧化自由氧离子，从而诱导清除酶的清除。L2下芒萁光能利用范围最大，而进行光合作用的细胞器叶绿体是产生活性氧的主要场所，无论是铵态氮的同化还是硝态氮的还原，均需要光合作用产生的能量[42]。因而，氮素的输入提高光能利用范围的同时不可避免的对活性氧水平及抗氧化酶活性产生影响，导致L2下MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性显著性升高。而L1下MDA含量显著降低，可能是SOD、POD、CAT活性的增加，起到了清除作用。

植物必需资源的分布具有时空异质性，常常呈现为“资源交互斑块性”特征[43]，亚热带低山丘陵区资源分布表现为暖性单优针叶群落下层弱光生境和养分丰富的土壤，而群落外缘则为强光生境伴随土壤贫瘠化。芒萁从弱光生境到强光生境均表现很强的生理可塑性，即强光下高的Pn和LSP、弱光下LCP和Rd低，因此芒萁在各种光环境条件下均能保持较高的生态适合度[44]。生境资源丰富能加速植物的定居扩散。施氮对芒萁光合作用能力及在弱光环境下的适应性均有一定促进作用，因此土壤肥力对芒萁在野外不同光环境下定居扩散并形成单优草本层片的现象有一定影响。至于何种范围的氮素变化对芒萁生长影响最大，以及芒萁作为为典型的根状茎克隆植物如何调节母株—分株系统应对环境资源变化，仍需要做进一步的研究。

由此可见，13.00%透光条件下更适合芒萁的生长发育，具有较高的光合作用潜能，随遮荫的增加，芒萁通过调节对弱光的利用能力适应遮光生境，表现出一定的耐荫性；L3下芒萁受光胁迫最严重，但其抗氧化保护酶活性显著上升，表现出一定的清除能力；遮荫是影响芒萁光合特征参数的主要因子，而MDA含量及抗氧化酶活性均受遮荫、氮素及其交互作用的显著性影响。