甘蓝中吡虫啉的残留量及清洗方式研究

马伟超，李一婧，曹会弟

（天水师范学院生物工程与技术学院，甘肃天水741001）

我国是一个农业大国，为确保农作物增产，在农业种植过程中大量使用各种化肥农药和人工合成物[1]。但农药在提高果蔬产量的同时也给蔬菜带来农药残留问题[2]，残留的农药严重污染了水、空气和土壤，再加上生物食物链的富集作用[3]，对人类的身体健康造成极大的威胁，严重时甚至会导致人畜出现中毒现象[4]，尤其是像甘蓝这样的人们日常膳食中必不可少的蔬菜。

甘蓝（Brassica oleracea L.）的学名是“结球甘蓝”，俗称包菜、莲花白、卷心菜、圆白菜等，在西方国家被看作保健价值很高的蔬菜[5]，里面含有多种微量元素，特别是边叶中钙含量可达26.5 g/kg，是叶球的3 倍多[6]，此外还有蛋白质、脂质、矿物质、维生素等。近年亦有研究表明，甘蓝多酚类化合物中的吲哚类化合物对癌细胞具有一定的抑制作用[7]。甘蓝可以做成各种各样好吃又营养的美食，也是天水地区制作浆水的主要原料之一。浆水作为天水的特色小吃，可以作为预防中暑的饮料，也可以消炎降血压，夏天常食有利于健康，用其做成的浆水面深受土生土长的天水人和外来游客的喜爱，因而甘蓝在天水地区被广泛种植。

吡虫啉是甘蓝种植过程中常用农药之一，主要防治蚜虫、叶蝉、飞虱、蓟马等刺吸式口器害虫[8]，其化学名为 1-（6-氯-3 吡啶甲基）-N-硝基咪唑-2-亚胺，具有很好的内吸传导性及高的选择性和生物活性[9]，吡虫啉具有神经毒性作用，能直接与乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AchR）结合，引起不断的刺激传递而缺少乙酰胆碱酯酶的消除能力，从而扰乱昆虫正常的神经活动[10]，所以吡虫啉是一种高效、内吸的广谱性杀虫剂[11]。除广泛应用于果蔬、花草等害虫防治外，还可用于家庭宠物卫生的防治，或用于运动场、高尔夫球场、社区等草坪害虫的防控[12]。

随着使用量的增加，吡虫啉对生物及人群的毒性影响得到了人们越来越多的关注。研究表明，吡虫啉对雄性大鼠经口LD50为681 mg/kg，雌性为825 mg/kg，经皮的LD50雌雄两性都大于2 150 mg/kg，中毒的大鼠表现为抑制作用，出现呼吸急促、侧卧等症状[13]。还有研究报道吡虫啉具有改变DNA 链完整性、染色体完整性和致突变性等遗传毒性[14]。闫文等对吡虫啉毒性研究发现一定浓度范围内的吡虫啉可能有潜在影响学习记忆的作用[15]。此外，吡虫啉对蜜蜂的毒性极高（LD50为 0.030 μg/只）[16]，欧洲食品安全局报道，包括吡虫啉在内的3 种烟碱类农药与蜜蜂数量大减有最为密切的关系，欧盟曾于2013年对其进行过为期两年的禁用[17]。此外，土壤对吡虫啉具有吸附性，而土壤中农药的移动性能是评价农药对地下水污染的重要指标，吡虫啉是具有中等移动性的农药品种，对地下水的污染有一定的影响[18]。可见吡虫啉对人体和生物环境都有极大的威胁，检测其残留量十分必要。

近年来，随着检测技术的逐渐完善，水果蔬菜中的农药残留的分析方法有了很大的突破[19]，目前吡虫啉残留的检测方法主要包括气相色谱法（gas chromatography，GC）[20]、高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）[21]、高效色谱-串联质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[22]、超高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）[23]、荧光法[24]、和胶体金免疫层析法（the gold immunochromatographic assay，GICA）[25]等。例如李广领等运用气相色谱法检测了卷心菜中吡虫啉的残留，结果显示吡虫啉在浓度为0.5 μg/L～100 μg/L 内有良好的线性关系，定量检测限分别为0.005 3 mg/kg，该方法准确度与精密度好，实用性强[20]。张雪辉等用高效液相色谱法测定了西红柿、结球甘蓝等几种蔬菜中的吡虫啉，先用乙腈提取样品，经过净化等处理，再用带有紫外检测器的高效色谱仪进行测定，得出吡虫啉在0.1 mg/L至1.0 mg/L 的添加范围内线性关系较好，线性关系系数R2为0.992 5，西红柿的平均回收率为95.4%～106.8%，相对偏差为2.66%～7.99%，最低检测限为0.01 mg/kg，表明该方法能较准确、快速地监测蔬菜中的吡虫啉[21]。梁秀美等用高效液相色谱-串联质谱法测定了蜂蜜与蜂花粉中吡虫啉及其代谢物，此方法中样品经酸化的乙腈提取两次，再经新型净化脱脂材料EMR 净化，检测结果显示，蜂花粉和蜂蜜中吡虫啉及其代谢物有良好的线性范围，其相关系数在0.999 2～1.000 0 之间，吡虫啉的检出限为 0.2 μg/kg，定量检出限为0.60 μg/kg，能满足定量分析的基本要求[22]。谭国新等用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定了上海青基质中的吡虫啉残留，表明吡虫啉在0.000 5 mg/L～0.5 mg/L 的线性范围内，线性相关系数在0.999 5 以上，吡虫啉的定量限低至3.1×10-6mg/kg，该方法灵敏度高，重现性好，满足国内外对农药残留分析的相关要求[23]。赵晓阳等用荧光法测定了苹果中的吡虫啉，确定了吡虫啉的最佳激发波长为234 nm，在苹果汁中吡虫啉的主特征波长为373 nm，且荧光强度随吡虫啉浓度的增加而增大，从而建立荧光法测定吡虫啉的方法，具有便捷、快速等优点[24]。楼小华等采用以柠檬酸三钠还原法制备的胶体金标记吡虫啉单克隆抗体的方法，创建并优化了胶体金免疫层析法，用胶体金免疫层析法快速检测了烟草中吡虫啉的残留，其检出限为5 μg/mL，检出结果经气相色谱法验证，符合率高达96%，说明胶体金免疫层析法可对烟草中的吡虫啉进行定性检测，而且整个分析过程耗时短，超不过20 min，此方法具有快速简便、灵敏度高等特点，适合市场监控、现场临时抽检等[25]。

综上所述，在众多的吡虫啉的检测方法中，荧光法和胶体金免疫层析法的检测结果都有不确定性，需要进一步的验证，过程繁琐；虽然几种液相的检测方法中检出限由高到低的排序是：超高效液相色谱-串联质谱法＞高效液相色谱-串联质谱法＞高效液相色谱法，但超高效液相色谱-串联质谱仪和高效液相色谱-串联质谱仪价格昂贵，许多实验室都没有配置；夏晓明等在综述中也提到有相关试验表明，气相色谱法不适合直接测定吡虫啉，带有紫外检测器的HPLC 法在各方面都优于GC，而且吡虫啉是一个极性强但对热不稳定的农药[26]，因此本试验采用高效液相色谱法研究天水市秦州区部分地区的甘蓝中吡虫啉的残留情况以及清洗方式对残留量的影响，为蔬菜购买地和清洗方式的选择提供建议。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试剂

吡虫啉标准溶液（1 mg/mL）：上海晶纯生化科技股份有限公司；吡虫啉标准工作液：用甲醇（色谱纯）稀释吡虫啉标准溶液1 000 倍至质量浓度为1 mg/L；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：默克股份有限公司；无水硫酸镁（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司，200 ℃灼烧2 h，冷却后置于干燥器中备用；乙腈（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；超纯水：ULUP-II-10T 优普超纯水器制得，电阻率为18.25 MΩ。

1.1.2 材料

甘蓝：购自坚家河菜市场（A）、瀛池菜市场（B）、兰天菜市场（C）、物美超市（D）、五洲超市（E）、兰天超市（F）；容量瓶（500、1 000 mL）：四川蜀玻（集团）有限责任公司；离心管（50 mL）、一次性注射器（1 mL）、0.22 μm有机滤膜、自封袋等：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

1260 型高效液相色谱仪（DAD 检测器）：美国 Agilent 公司；ULUP-II-10T 型超纯水器：四川优普超纯科技有限公司；ME4002E 型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；H2100R 医用离心机：长沙开发区湘仪离心机仪器有限公司；D500 均质机：北京大龙兴创实验仪器有限公司；A17 型破壁机：佛山市顺德区格明电器实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的采集

早上9 点左右去6 个销售地点采样，连续采3 d，将3 d 采的样各取50 g（整个叶球的四分之一或八分之一）按购买地分类存放在冰箱的塑料袋中，3 个菜市场的甘蓝边叶按照相同的方法存放。

1.3.2 样品的制备

将分好的样品放入破壁机中匀浆，然后分别装入贴好地方标签的自封袋中，在冰箱中于-4 ℃保存。其中需要清洗的样品在清洗时浸泡5 min，清洗完等自然晾干后再匀浆，每匀浆完1 个样品，都要清洗破壁机，以免样品之间交叉污染。

1.3.3 吡虫啉标准曲线的测定

将配置好的浓度为1 mg/L 的吡虫啉标准工作液分别按 0、4、5、10、15、20 μL（即 0、4、5、10、15、20 ng）进样。

检测条件为色谱柱：ZORBAX SB-C18 柱，250 mm×4.6 mm，5 μm（美国 Agilent）；检测波长：270 nm；柱温：40 ℃；流动相：乙腈/水=40/60（体积比）；流速：1.0 mL/min；样品进样量：20 μL。

1.3.4 甘蓝中吡虫啉残留检测

吡虫啉的测定参考国家农业标准NY/T 1275-2007《蔬菜、水果中吡虫啉残留量的测定》[27]：准确称取10 g 左右（精确至0.01）样品于50 mL 具塞离心管中，加入乙腈10 mL，在高速均质机上均质2 min，然后加入无水硫酸镁6 g，在涡旋振荡器上振荡摇匀后静置30 min，在转速为4 000 r/min 的离心机上离心4 min，用移液枪将上清液全部转入另一50 mL 的具塞离心管中，用氮吹仪40 ℃下浓缩至干，然后加入1 mL 的甲醇溶解，超声20 s 保证它们充分溶解，再经0.22 μm 的有机膜滤入进样瓶，每份样品做3 个平行样，待测，检测条件同上。

1.3.5 数据分析

试验数据使用SPSS V20（IBM 公司）进行分析，各试验条件数据均采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey Post Hoc 检验。图表制作使用OriginPro 8.1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

吡虫啉标准曲线图见图1。

图1 吡虫啉标准曲线图Fig.1 Standard curve of imidacloprid

以吡虫啉的含量（0、4、5、10、15、20 ng）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线图，由图1 可以看出，吡虫啉在色谱柱为 C18 柱，250 mm×4.6 mm，5 μm、检测波长为270 nm、柱温为40 ℃、流动相为乙腈+水（40+60）、流速为1.0 mL/min 的条件下有较好的线性关系，线性回归方程方程为y=2.660 4x+0.716 7，相关系数R2为0.998 6。

2.2 不同来源的甘蓝中吡虫啉的残留情况

对不同销售地点采购的甘蓝中吡虫啉残留量进行了检测见图2。

图2 不同来源的甘蓝中吡虫啉的残留量Fig.2 Imidacloprid residues in cabbage from different market

由图2 可知，坚家河菜市场（A）的吡虫啉含量明显高于其他地方（p=0.013，α=0.05），吡虫啉残留量达到0.25 mg/kg，但未超过GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定甘蓝中吡虫啉的最大残留量为1 mg/kg[28]。高的原因可能是甘蓝在生长的每个阶段都在使用吡虫啉，而且喷药间期太短，造成了农药在甘蓝中的积累。兰天超市的甘蓝未检出，说明之前没有喷洒农药或早期喷洒的吡虫啉降解，残留量太小而未检出。菜市场的甘蓝中吡虫啉的残留量普遍高于超市的，其可能的原因是菜市场卖家一般都是当地的菜农，喷药的时间和方式一般很随意，次数也比较频繁，没有食品安全意识。而超市在采购蔬菜时通常会对农药残留进行快速检测，一定程度上控制了蔬菜种植过程中的农药使用量和喷药时间。

2.3 甘蓝边叶与叶球中吡虫啉残留量的比较

根据形态的变化，甘蓝的生长过程一般分为幼苗期，定植期，始球前期，结球期和收获期[29]，可见边叶比叶球形成的早，所以经历的喷药次数也多，而且两者结构形态不同，使人们产生了边叶中农药残留量多于叶球的误解。因此，对3 个菜市场的甘蓝边叶与甘蓝叶球中吡虫啉残留量进行了测定，坚家河菜市场（A）采购的甘蓝叶球与另外两个市场销售的甘蓝叶球存在显著差异（p＜0.01，α=0.05），坚家河菜市场（A）销售的甘蓝边叶与兰天菜市场（C）销售的甘蓝边叶有显著差异（p=0.029，α=0.05），结果见图3。

有研究表明吡虫啉在水中即使无催化剂也能在紫外光照射下会被降解成简单的无机物，并且光照强度越大，降解速度越快[30]，作为在最外层的边叶，它们受到的阳光照射和雨水比叶球多，导致部分农药降解；甘蓝边叶吸收的养分会向叶球运输[6]，所以残留在土壤中的吡虫啉经根部吸收，再由边叶转运给叶球，再加上吡虫啉是一种内吸性农药，蔬菜的不同部位对吡虫啉的吸收不同[31]，这几点导致叶球中吡虫啉的含量大于边叶。

图3 3 个菜市场的甘蓝边叶和叶球中的残留量Fig.3 Imidacloprid residues in side leaves and leafballs of cabbage from three vegetable markets

2.4 同一来源的甘蓝清洗效果的比较

由于购自坚家河菜市场（A）的甘蓝检测出少量吡虫啉的残留（如2.2 和2.3 所示），为研究不同清洗方法对吡虫啉的去除效果，选用采购于A 市场的甘蓝为研究材料，分别将边叶和叶球使用清水、淡碱水（1.5%）和盐水（0.9%）浸泡5 min，而后清洗、自然晾干后再匀浆、检测。以未清洗的甘蓝为对照，得出不同清洗方法的吡虫啉去除效果如图4 所示。

图4 不同清洗方式处理后甘蓝中吡虫啉的残留量及去除率Fig.4 Residue and removal rate of imidacloprid in cabbage treated by different cleaning methods

虽然3 种清洗方式都能减少农药的残留量，但碱水和盐水的去除效果比清水好，清水对边叶的去除率为18.1%，叶球的去除率为80.09%，碱水和盐水对边叶和叶球的去除率都为100%，这与吡虫啉的性质有关，有研究表明，吡虫啉在中性或酸性条件下水解不明显，在弱碱条件下能缓慢水解，并且随着碱性增强，水解的速度也会明显加快[32]。清水对边叶和叶球的去除率也有明显的差异，主要由于吡虫啉在水中的溶解度为 0.51 g/L（20 ℃），在水中有一定的溶解度[33]，甘蓝叶球的水分含量比边叶大，因而叶球比较容易除去。所以洗菜的时候可以用少量的盐和碱等有效的去除剂来减少果蔬中的农残，洗边叶的时候可以多洗几次。

农药是一把双刃剑，适当地使用会提高农产品产量，大量使用会降低农产品的质量[34]。农药在现代农业生产中不可或缺，过量使用会导致环境污染和人体健康的损害等一系列问题，对于这种现象，政府相关部门应一方面加强宣传教育，提高果树种植户对农药危害的认识，使他们能合理使用农药，学习农药正确的使用方法，掌握好农药的安全间隔期。另一方面加大监管力度，制定合理的管理规则，保证食品质量安全[35]。作为消费者，也应该有食品安全意识，在买菜时去相对正规的地方去买，在食用时应选择有效的清洗方式。

3 结论

本文利用高效液相色谱法检测了天水市区不同销售地点的甘蓝中吡虫啉的残留量，并对比了甘蓝的边叶和叶球上吡虫啉残留量，以及不同清洗方式对残留的吡虫啉去除效果，主要得出3 个结论（1）天水市秦州区不同销售地点采购的甘蓝中的吡虫啉残留量均未超出GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》要求；（2）甘蓝叶球的残留量高于边叶；（3）使用碱水和盐水清洗可有效去除甘蓝中残留的吡虫啉。