野生椒蒿总黄酮的纯化工艺及抗氧化活性研究

吴昊，唐涛浪，刘伟，闫秀玲

（伊犁师范大学化学与环境科学学院新疆维吾尔自治区教育厅普通高等学校重点实验室，新疆伊宁835000）

黄酮广泛的存在于植物中，目前的研究表明，黄酮类化合物具有一定的抗炎镇痛[1]、抗肿瘤[2]、抑菌[3]、治疗心脑血管疾病和免疫调节作用[4]，最近的研究还表明，黄酮类化合物对糖尿病肾病有一定的预防作用[5]。

椒蒿（Artemisia dracunculus L.），被子植物门，具有类似花椒的气味，多年生草本植物，分布在我国北部及西北部，椒蒿富含胡萝卜素、维生素C、生物碱、钙、锌等微量元素。椒蒿具有增强免疫力，治疗风寒感冒，同时具有一定的免疫调节功能[6-8]，也有记载椒蒿曾被用于治疗水肿和抗坏血病。

近几十年发展起来的大孔吸附树脂是一种高分子聚合物。目前广泛用于中药行业和天然产物中的各类有效成分的纯化，具有成本低、选择性好、吸附速度快、洗脱速度快、吸附容量大和使用寿命长等特点[9-10]。

根据目前的研究现状，已有研究人员运用GC-MS对椒蒿当中挥发油的化学成分及其生物活性进行了分析[11]，另外也有研究人员对黄酮提取工艺进行了研究[12]，但目前关于椒蒿的研究还主要是侧重于挥发油成分分析及生物活性研究，以及对椒蒿中总黄酮的粗提取，并未见关于椒蒿总黄酮提取之后的纯化方法及抗氧化活性的报道，所以本文应用对天然产物具有良好富集效果的大孔吸附树脂对椒蒿中的总黄酮进行纯化，分析对纯化过程中的相关影响因素，并采用ABTS+对纯化后的总黄酮进行抗氧化活性分析，以期为野生椒蒿的综合利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

椒蒿样品均是5 月采于新疆伊犁察布查尔县乌孙山，采摘部位是尖端部分（生长期），将新鲜采摘的椒蒿进行阴干粉碎；标准品芦丁（纯度≥95%）：上海源叶生物科技有限公司；7 种大孔吸附树脂为：HPD-100、HPD-600、HPD-826、ADS-17、X-5、AB-8 和 D101：东鸿化工有限公司；ABTS+：上海伊卡生物试剂；维生素C：天津北辰方正试剂厂；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠：天津福晨化学试剂厂；无水乙醇（分析纯）：天津北联精细化学品开发公司。

1.2 试剂

UV-250 紫外分光光度计：日本岛津公司；BSA124S电子天平：德国赛多利斯公司；HH-S1 型数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；Precision MLG3 旋转蒸发仪：德国海道尔夫集团；BAO-150AG 型真空干燥箱：施都凯仪器设备上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的预处理

取阴干的椒蒿粉末250 g，放到索氏提取器中，加入10 倍～15 倍的石油醚，反复抽提10 h，挥干石油醚后，将椒蒿粉末置于干燥箱内50 ℃恒温干燥6 h。

1.3.2 野生椒蒿总黄酮粗提物的制备

将处理过的椒蒿粉末按照料液比1 ∶30（g/mL）、温度85 ℃、体积分数为40%的乙醇溶液回流提取1 h，过滤，将滤液减压浓缩至稠膏，加蒸馏水定容，4 ℃保存备用。

1.3.3 标准曲线的绘制

以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法[13]测定野生椒蒿总黄酮含量。芦丁在烘箱中以105 ℃干燥至恒重，在干燥器当中冷却后，称取10 mg 用40%的乙醇溶解，定容到10 mL 的容量瓶中，再精确吸取2.5 mL 至25 mL 的容量瓶中。用40%乙醇稀释定容，即得100 μg/mL 的芦丁标准溶液。

吸取芦丁标准溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，分别加入0.5 mL 的5%NaNO2溶液，揺匀后放置6 min，再加入0.5 mL 的10%Al（NO3）3溶液，揺匀后静置6 min，加入4%的NaOH溶液4.0 mL，体积分数为40%的乙醇定容，揺匀后静置15 min。在510 nm 处测量吸光度。以x（芦丁质量浓度，mg/mL）为横坐标，以y（吸光度）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线。

回归方程为：y=14.788x-0.021 2（相关系数：R2=0.999 7）

1.3.4 总黄酮含量测定

吸取一定量的粗提液按照1.3.3 方法显色，根据回归方程测定样品中黄酮的质量浓度。

1.3.5 树脂预处理

称取 D101、AB-8、HPD-100、HPD-600、HPD-826、X-5、ADS-17，7 种树脂各 3 g，按照参考文献[14]的方法进行预处理。

1.3.6 测定树脂吸附量、吸附率及解吸率

选取洁净的具有具塞磨口的锥形瓶，将已处理好的各型号树脂（3 g）倒入锥形瓶，加入30 mL、1.18 mg/mL的粗提液，在25 ℃恒温振荡器振荡12 h，振荡频率120 r/min。吸附平衡后，过滤，将过滤后的不同型号树脂分别置于锥形瓶当中，加入30 mL 无水乙醇，解吸12 h。将一定量的吸附后溶液和解吸后的溶液，加入到10 mL 容量瓶内按照1.3.3 的方法显色，于510 nm 波长下测量吸光度，按照下面的公式计算不同型号树脂的吸附量、吸附率和解析率[15]。

吸附量=[（C0×V0）-（C1×V1）]/m0

吸附率/%=[（C0×V0-C1×V1）/C0×V0]×100

解析率/%={C2×V2/[（C0×V0-C1×V1）]}×100

浸膏中总黄酮含量/%=（m2/m1）×100

式中：C0为椒蒿粗提液中总黄酮质量浓度，mg/mL；V0为粗提液的体积，mL；C1为大孔吸附树脂吸附后的溶液中总黄酮质量浓度，mg/mL；V1为大孔吸附树脂吸附后的溶液的体积，mL；C2为解吸液中总黄酮浓度，mg/mL；V2为解吸液体积，mL；m1为干燥解吸液后的固体质量，mg；m2为解吸液当中总黄酮质量，mg。

1.3.7 树脂的吸附试验

1.3.7.1 大孔吸附树脂对野生椒蒿总黄酮的静态吸附试验

选取洁净的具有具塞磨口锥形瓶，将3 g AB-8 型大孔吸附树脂小心装入到锥形瓶中，倒入30 mL 1.27 mg/mL的野生椒蒿总黄酮粗提液，然后将其放入恒温振荡器中，选择温度为 25 ℃，转速 120 r/min，振摇6 h，每隔0.5 h 各取1 mL 测定黄酮质量浓度，绘制静态吸附动力学曲线。

1.3.7.2 吸附液pH 值对大孔吸附树脂吸附率和吸附量的影响

选取洁净的具有具塞磨口锥形瓶，将3 g AB-8 型大孔吸附树脂小心装入到锥形瓶中，设置pH 值为4、5、6、7、8 各 30 mL 的粗提液然后将其放入恒温振荡器中，选择温度为25 ℃，转速120 r/min，振摇12 h，测定吸附后溶液中的野生椒蒿总黄酮质量浓度并计算吸附率。

1.3.8 AB-8 大孔吸附树脂对野生椒蒿总黄酮的动态吸附试验

1.3.8.1 动态累计泄露曲线

采用湿法，将处理好的AB-8 型树脂缓慢装柱，吸附柱的大小为：1.5 cm × 30 cm，25 ℃下将 1 mg/mL 的粗提液按1 BV/h 的流速上样，按照柱体积（BV）收集流出液，测定每一份柱体积（50 mL）流出液中总黄酮的质量浓度，泄漏点为流出液中总黄酮浓度为纯化前粗提液总黄酮浓度的1/10，绘出泄露曲线。

1.3.8.2 质量浓度对AB-8 大孔吸附树脂的吸附量影响

把野生椒蒿黄酮的粗提液用蒸馏水稀释成黄酮质量浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mg/mL 的待上样液各200 mL，使粗提液的pH 值为4，以2 BV/h 的流速加入含有50 mL AB-8 大孔吸附树脂的柱子吸附，测定其纯化后流出液中总黄酮的质量浓度并计算此时的吸附率。

1.3.8.3 流速对AB-8 大孔吸附树脂的吸附量影响

取浓度1 mg/mL 的野生椒蒿总黄酮粗提液200 mL，加入含有50 mL AB-8 大孔吸附树脂的吸附柱中，分别调节流速为 1、2、3、4、5 BV/h，加入装有 50 mL AB-8大孔树脂的吸附柱中进行吸附，测定纯化后流出液当中总黄酮的质量浓度，并计算吸附率。

1.3.8.4 洗脱剂用量对AB-8 大孔树脂解吸椒蒿总黄酮的效果影响

将浓度1 mg/mL 的野生椒蒿总黄酮粗提液200 mL，加入含有50 mL AB-8 大孔吸附树脂的吸附柱中，调节流速2 BV/h 进行吸附，吸附饱和，使用60%乙醇溶液进行洗脱，调节洗脱剂流速2 BV/h，分别收集每一柱体积（BV）的洗脱液，并测定其中的黄酮含量。

1.3.8.5 不同浓度乙醇溶液对AB-8 吸附饱和树脂的洗脱分析

将浓度1 mg/mL 的野生椒蒿总黄酮粗提液200 mL，加入含有50 mL AB-8 大孔吸附树脂的吸附柱中，调节流速为2 BV/h，进行吸附，吸附饱和后，分别用体积分数20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液200 mL对吸附饱和的树脂进行洗脱，测定不同体积分数的洗脱液中总黄酮的质量浓度。

1.3.9 清除ABTS+试验

参考荆常亮[14]的方法，取7 mmol/L 25 mL ABTS+溶液与25 mL 2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液混合、避光静置20 h，得ABTS+反应液，将1 mL ABTS+反应液加入到100 mL 无水乙醇中，之后用无水乙醇将该溶液逐级稀释到吸光值为（0.7±0.02）。取各浓度（0.2、0.4、0.6、1.0、1.8 mg/mL）的VC和纯化后的野生椒蒿总黄酮提取液0.1 mL 与ABTS+反应液混合，避光反应30 min 后，在734 nm 波长下测定吸光度值，根据公式测定ABTS+的清除率。

2 结果与分析

2.1 树脂类型的筛选

为筛选出最适合的纯化野生椒蒿的大孔吸附树脂，本试验比较了7 种不同类型的大孔吸附树脂对野生椒蒿总黄酮粗提液的吸附特性，结果见表1。

2.2 静态吸附动力学曲线

为得到吸附平衡时间和平衡时的最大吸附量，需绘制出静态吸附曲线，AB-8 大孔吸附树脂对野生椒蒿总黄酮的静态吸附曲线见图1。

如图1 所示，在吸附的 0.5 h～2.5 h 内，AB-8 大孔吸附树脂对野生椒蒿总黄酮的吸附量随着时间的增加而快速上升，在2.5 h 以后，树脂对总黄酮的吸附量接近平衡。AB-8 大孔吸附树脂对野生椒蒿总黄酮的吸附率为80.2%。分析可知，AB-8 大孔吸附树脂对野生椒蒿总黄酮具有较强的吸附性能，在吸附2.5 h 后达到饱和。

表1 7 种大孔吸附树脂的性质及静态吸附和解析性能Table 1 Properties and static adsorption and desorption ability of seven macroporous resins

图1 AB-8 大孔吸附树脂对野生椒蒿总黄酮的静态吸附曲线Fig.1 Static adsorption curve of total flavonoids of Artemsia dracunculus L.on AB-8 macroporous resin

2.3 吸附液pH值对吸附量的影响

在不同的pH 值下黄酮对树脂的亲和力有所不同，不同pH 值下野生椒蒿总黄酮吸附率和吸附量见图2。

图2 不同pH 值下野生椒蒿总黄酮吸附率和吸附量Fig.2 Adsorption rate and adsorption amount of total flavonoids in Artemsia dracunculus L.at different pH values

如图2 所示，溶液的pH 值对样品的总黄酮吸附率和吸附量有产生了比较大的影响。pH 值从8 下降到7 时吸附率有微小的提升，当酸度从pH7 逐渐降到pH4 时，吸附率发生大幅度提升，至pH4 时达到最高。故而选取pH4 为最佳上样pH 值。出现这个现象，推测是因为黄酮中的多酚和糖苷键表现出的弱酸性所致[16]。在pH4 的酸性环境中，树脂以氢键方式对其进行吸附，进而结合的较为牢固，而在碱环境中，其上的酚羟基上以酸根离子形式存在，与树脂结合力不如氢键强，从而降低了吸附率，因此AB-8 大孔吸附树脂在pH4 的弱酸性条件下对椒蒿总黄酮的吸附效果最好。

2.4 泄露曲线考察

为确定出最佳的上样体积，需绘制泄露曲线，野生椒蒿总黄酮在AB-8 大孔吸附树脂上的泄露情况见图3。

图3 野生椒蒿总黄酮在AB-8 大孔吸附树脂上的泄露曲线Fig.3 Leakage curve of total flavonoids from Artemsia dracunculus L.on AB-8 macroporous resin

当流出液中目标成分的浓度为上样液中目标成分浓度的1/10 时，认为是泄漏点，由图3 可知，随着流出液体积的增加流出液中黄酮的质量浓度也随之迅速增加，将其与上样液相比较，发现流出液在5 BV 时，发生泄漏，因此确定上样体积为1 BV～5 BV。

2.5 质量浓度对吸附效果的影响

为了发挥出大孔吸附树脂的全部吸附性能，提高吸附效率，需探究质量浓度对吸附效果的影响，质量浓度对AB-8 大孔吸附树脂的吸附量及吸附率的影响见图4。

图4 质量浓度对AB-8 大孔吸附树脂的吸附量及吸附率的影响Fig.4 Effect of mass concentration on adsorption capacity and adsorption rate of AB-8 macroporous resin

如图4 所示，随着质量浓度的增加，吸附率和吸附量逐渐上升，在1 mg/mL 后虽然吸附量依旧较大（树脂有可能已经饱和），但是吸附率出现了较明显的下降，故最终确定最佳上样浓度为1 mg/mL。

2.6 流速对吸附效果的影响

上样时的流速会显著影响吸附过程中的动力学过程，为了寻找流速与吸附效果的平衡点，需要探究流速对吸附量和吸附率的影响，不同流速下对吸附效果的影响见图5。

图5 不同流速下的吸附效果Fig.5 Adsorption effect of different eluants at different flow rates

如图5 所示，当流速为2 BV/h 吸附量最大，随着流速逐渐增大，吸附率也逐渐下降，原因可能是因为当流速过大时，传质效率降低，使得野生椒蒿总黄酮成分还没有被及时吸附就已经随洗脱液流出吸附柱。

2.7 洗脱剂用量的确定

为了使用尽可能少的溶剂，使黄酮充分洗脱下来，需要探究洗脱剂的用量对洗脱效果的影响，不同洗脱剂用量对野生椒蒿总黄酮洗脱的影响见图6。

从图6 可以看出，当洗脱剂体积增加时，洗脱液中总黄酮质量浓度随之减小，当洗脱剂体积用量达到4 BV积时，洗脱液中总黄酮浓度已经小于0.1 mg/mL，表明此时树脂上的黄酮类化合物已被充分洗脱，故确定洗脱剂用量为4 BV。

图6 不同洗脱剂用量对野生椒蒿总黄酮洗脱的影响Fig.6 Effect of different amount of eluting agent on total flavonoids of Artemsia dracunculus L.

2.8 不同体积分数乙醇溶液对洗脱的影响

洗脱剂的浓度也会影响洗脱效果，洗脱剂的浓度过大或过小都会导致目标成分与树脂的结合不能完全破坏。不同乙醇体积分数下的洗脱效果见图7。

图7 不同乙醇体积分数下的洗脱效果Fig.7 Elution effect of different ethanol concentration

如图7 所示，在乙醇体积分数20%～60%的范围内，随着乙醇体积分数的增大，解吸率随之增大，在乙醇体积分数为60%时，解吸率最大，为95.30%，表明此时大部分黄酮类化合物均被洗脱，此后随着乙醇体积分数继续增大，洗脱率随之减小，故确定最佳洗脱剂的乙醇体积分数为60%。

2.9 ABTS+清除活性

野生椒蒿总黄酮对ABTS+自由基的清除能力见图8。

图8 野生椒蒿总黄酮对ABTS+自由基的清除能力Fig.8 Antioxidant capacity of Total flavonoids from Artemsia dracunculus L.to ABTS+free radical

由图8 可以看出，随着VC溶液和纯化后野生椒蒿总黄酮溶液质量浓度的增加，对ABTS+的清除率逐渐增大，其抗氧化活性逐渐上升，其抗氧化活性和浓度呈一定的依赖性，当野生椒蒿总黄酮提取液质量浓度从0.2 mg/mL 增加到1.6 mg/mL 时，对ABTS+的清除率从7.7%增大到86.4%，当VC质量浓度从0.2 mg/mL增加到1 mg/mL 时，对ABTS+的清除率从25.3%增大到98.6%，当浓度高于1 mg/mL 时，其清除ABTS+的活性没有显著增加，在此次试验条件下，由SPSS 计算可得VC的IC50值为0.411 mg/mL ，野生椒蒿总黄酮的IC50值为1.068 mg/mL，野生椒蒿总黄酮对ABTS+的清除活性小于VC。

3 结论

本试验以吸附量、吸附率和解吸率为指标，探究了运用大孔吸附树脂对野生椒蒿总黄酮的工艺条件，比较了 HPD-100、HPD-600、HPD-826、ADS-17、AB-8、X-5 和D101，7 种不同类型的大孔吸附树脂对野生椒蒿总黄酮的分离纯化效果，结果表明，比较适合纯化野生椒蒿总黄酮的树脂类型为AB-8 型大孔吸附树脂，其对野生椒蒿总黄酮的平均吸附量为9.12 mg/g、平均吸附率为77.29%、平均解吸率为74.56%。通过静态-动态吸附试验，明确了AB-8 型大孔吸附树脂纯化野生椒蒿总黄酮的工艺条件：上样液浓度为1 mg/mL、上样流速为2 BV/h、上样量为5BV、洗脱剂为体积分数60%的乙醇溶液，洗脱剂用量为4 BV，在上述条件下，野生椒蒿总黄酮提取液经AB-8 型大孔吸附树脂纯化后，干浸膏中总黄酮含量13.62%上升到52.4%。

体外抗氧化试验表明，野生椒蒿总黄酮对ABTS+具有一定的清除活性，且清除活性随着质量浓度的增加而增加，野生椒蒿总黄酮对ABTS+的IC50值为1.068 mg/mL。以上所有试验结果为野生椒蒿这种食药兼具的野菜在药品、食品行业的综合利用提供了一定的理论基础。