响应面法优化雨生红球藻产虾青素培养条件

李嘉仪，窦勇，邵蓬，高金伟，贾旭颖，张文慧，王祎哲，马婷，周文礼

（天津农学院 天津市渔业资源与环境研究室，天津 300384）

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种淡水单细胞藻类。当雨生红球藻细胞受到外界环境胁迫时，会转变成厚壁孢子状态，其特征主要表现为细胞进入孢囊期，鞭毛慢慢脱落，运动速度降低直至不游动，色素由核周围逐渐向四周扩散，由绿色最终变为红色[1-2]。红色酮类胡萝卜素虾青素（3，30-二羟基-β，β-胡萝卜素-4，40-二酮）是最强大的生物抗氧化剂，研究表明，虾青素可能在抗抑郁和预防 UVA诱导所致的皮肤老化方面有一定效果[3-6]。当雨生红球藻细胞处于胁迫条件下，如营养缺乏，高辐射或高盐浓度时，虾青素以脂肪酰基单酯或二酯的形式产生[7]。目前，雨生红球藻是天然虾青素的最佳来源，占细胞干重的4%[8-10]。

雨生红球藻积累虾青素的关键是胁迫条件，胁迫条件显著影响积累虾青素的含量。齐安翔等[11]研究表明，环境因子胁迫条件下，雨生红球藻由绿色营养细胞快速转变为厚壁孢子，并积累虾青素。才金玲等[12]认为，高光照强度使雨生红球藻光合作用和氮类化合物的代谢反应减弱，藻细胞出现胁迫应激，细胞内与虾青素合成的有关基因被激活，胞内开始合成并积累虾青素。光照胁迫应激下，能使雨生红球藻中虾青素的合成量增高并保护光合色素，但当光照应激程度超过雨生红球藻抵抗范围，细胞就会受到损伤而降低虾青素的产量[13]。盐胁迫是雨生红球藻合成虾青素常用的技术方法之一，探究适宜的盐浓度范围对雨生红球藻高效合成虾青素有重要研究意义[14]。Cordero等[15]研究表明，2% NaCl是虾青素生产的最佳盐度，盐度过高会导致雨生红球藻大量死亡。Boussiba等[16]研究表明，光照强度、磷酸盐和盐胁迫会抑制细胞生长，降低分裂速率，但会积累大量虾青素。有研究认为，雨生红球藻在缺氮条件下，细胞分离速度降低，会形成厚壁孢子并积累虾青素[17]。本文以光照强度、NaCl和NaNO3为胁迫条件，优化雨生红球藻虾青素积累的环境因子组合，旨在为雨生红球藻大规模培养并大量积累虾青素提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 雨生红球藻的培养

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）来源于天津市水产生态及养殖重点实验室。使用BBM培养基培养[11]，培养温度设定（22±1）℃，营养细胞阶段光强设定为2 000～2 200 lx，每天摇动培养瓶数次，防止细胞附壁或下沉。

1.2 试验方法

1.2.1 雨生红球藻的胁迫处理条件

将培养至对数期的雨生红球藻离心（4 000 r/min，10 min），得到的藻细胞用不含有NaNO3和NaCl的新鲜BBM培养基冲洗两次，将得到的不含NaNO3和NaCl的雨生红球藻细胞密度调整到5×104cell/mL，进行胁迫试验。通过前期试验培养确定NaNO3浓度为0、0.13和0.25 g/L；NaCl浓度为0、2.5和5.0 g/L；光照强度为5 000、7 000和9 000 lx，以光照强度（A）、NaNO3浓度（B）和 NaCl浓度（C）等因素作为考察对象，以虾青素含量（Y）为响应值，采用Design Expert 8.0统计分析软件的响应面分析法优化试验，共有17个试验点（中心点重复5次，用于估计试验误差），以获取最优胁迫条件参数。

1.2.2 虾青素含量的测定

取出5 mL藻液进行离心，弃去上清液，加入5 mL超纯水清洗，重复两次。然后用5 % KOH＋30%甲醇破坏叶绿素5 min，弃去上清液后加 5 mL超纯水清洗两次。弃去上清液，收集到藻体中，加入2 mL丙酮，用细胞破碎仪处理10 min，4 ℃离心15 min（10 000 r/min），保留上清液，重复以上操作，直至藻团呈白色，色素提取完全为止。

虾青素含量采用公式[18]:

Astaxanthin（mg /L）＝4.6×A480ast×稀释倍数

1.3 数据处理

使用 SPSS 17.0 统计软件对虾青素含量所有数据进行单因素方差分析，采用 Duncan’s 多重比较检验均值的差异显著性，差异显著性水平为0.05。利用EXCEL 2007进行绘图。

试验设计使用 Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken方法的响应面试验设计，并对数据进行相关线性拟合，通过拟合后线性关系制作预测结果等高线和响应曲面图。

2 结果与分析

2.1 响应面分析

选用Box-Behnken响应面试验方法[19-23]，将光照强度、NaNO3浓度和NaCl浓度进行响应面设计，Box-Behnken响应面设计试验的因素和水平见表1，设计3因素3水平试验总共17组Box-Behnken响应面分组，得到虾青素含量见表2，将所得表2中数据通过 Design-Expert软件拟合方程[24-25]，拟合得到回归方程如下:

表1 Box-Behnken响应面设计试验的因素和水平编码

表2 试验方案设计及响应值结果

2.2 响应面分析结果

对回归方程Y进行方差分析，结果见表3，该拟合模型有显著性（P＜0.05），由系数显著性检验结果可知，方程A-A（P＜0.01）和C-C（P＜0.01）对雨生红球藻积累虾青素含量的线性效应极显著，而B-B则不显著（P＞0.05）。3种胁迫对雨生红球藻积累虾青素含量影响效果为C＞A＞B。二次项中C2（P＜0.05）有显著影响。模型中A、C因素均对虾青素含量有显著影响，交互项A和B、A和C、B和C均有影响，但不显著（P＞0.05），因此，可认为3种胁迫方式对虾青素产生交互式影响较小。F值为5.15意味着该模型具有重要意义，仅2.09%的可能性是由于失拟概率产生的“模型F值”。说明该拟合符合实际，该模型能较准确反映光照强度、NaNO3浓度和NaCl浓度对雨生红球藻胁迫高产虾青素的效果。

表3 拟合曲线模型方差分析结果

拟合曲线方差分析结果中相关系数见表4，其中决定系数R2＝0.868 9，校正系数RAdj＝0.700 2，通过换算不到0.03%变异模型不能由此模型解释，表明该模型与实际拟合相符。当Adeq测量精度大于 4时是可用的，该模型中 Adeq测量精度为8.316，表明该模型可以用于设计并预测胁迫条件对雨生红球藻高产虾青素的结果。

表4 拟合曲线模型方差分析结果

从上述方差结果可以得到，通过模型可以较好地拟合3种不同胁迫条件对雨生红球藻高产虾青素的效果，为了更加体现研究具体数值较优胁迫效果，使用Design-Expert软件对3种不同胁迫条件对雨生红球藻高产虾青素含量进行等高线以及响应面图制作并进行分析。

响应曲面图和等高线图可以直观表示试验因素的3个水平间与响应值的函数关系，获取试验设计中最优工艺参数。从图1中可以看出，当NaCl浓度为2.5 g/L时，光照强度和氮浓度交互作用对雨生红球藻积累虾青素含量的影响。这两个因素交互作用不显著，随着光照强度和 NaNO3浓度降低，虾青素含量缓慢提高，当光照强度达到9 000 lx和NaNO3为0 g/L条件下，相互交互效果最佳。

图1 因素A和B交互作用的等高线和响应面

NaNO3浓度为0.13 g/L时，光照强度和NaCl浓度交互作用对雨生红球藻积累虾青素含量的影响，这两个因素交互作用显著，从图2中可以看出，NaCl浓度在1.25～2.50 g/L时胁迫效果最佳，盐浓度越高积累虾青素效果越差。

图2 因素A和C交互作用的等高线和响应面

光照强度为7 000 lx时，NaCl和NaNO3交互作用对雨生红球藻积累虾青素含量的影响，两因素交互作用不显著，NaCl浓度为2.5 g/L、NaNO3为0.13 g/L时，积累虾青素含量最高为5.0 mg/L（图3）。

图3 因素B和C交互作用的等高线和响应面

3 讨论

由于雨生红球藻中虾青素在胁迫条件下积累明显，因而绝大多数采用胁迫条件处理方法，但不同胁迫条件和胁迫程度对积累虾青素效果会有较大差别。研究雨生红球藻实现高产虾青素一直是本行业的重要课题。本研究通过利用RSM（响应面法）允许响应面的可视化表示作为定位最大点的直接手段，并且通过适当计算机程序的可用性，数学操作被简化为常规程序，筛选积累虾青素的条件来进一步实现高产虾青素这一目的。这种统计方法可以很容易地应用于大多数微藻及其产品，这为RSM应用于任何藻类发酵过程开辟了道路，以优化关键参数并实现最大的藻类生长[13]。Niizawa等研究雨生红球藻在氮饥饿条件下，光照强度达到110 µmol/（m2·s）时，虾青素浓度增加至干生物量的2.7 %，并在应激阶段有效利用光能[26-27]。虾青素是藻类细胞中的主要叶黄素，这些叶黄素在培养条件下作为藻类细胞中的脂肪酸酯存在。光照水平对虾青素积累率有重要影响。Saeki等还发现加入 NaCl促进这些游离和酯型叶黄素的合成，较高的光和盐胁迫协同激活藻细胞中的胡萝卜素生成[28]。在氮缺乏和高光条件下，盐的补充会增强培养物中酯化的虾青素、玉米黄质的合成。

4 结论

光照强度和NaCl对雨生红球藻积累虾青素有极显著影响（P＜0.01）；NaCl浓度为 2.5 g/L、NaNO3为0 g/L、光照为9 000 lx时，雨生红球藻积累虾青素含量最高，达6.80 mg/L。