云南云岭牛桑叶营养价值的评价

王宁伟，黄先智，刘建勇，黄必志，沈以红

（1.西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400715；2.农业部蚕桑功能基因组与生物技术重点实验室，重庆 400715；3.云南省草地动物科学研究院，云南 昆明 650212）

随着我国养殖业的快速发展，饲料蛋白源不足问题日趋严重，开发新型饲料蛋白源迫在眉睫。桑树已收录于我国农业部列入饲料目录中，粗蛋白含量在200 mg·g-1干物质以上[1]，具备作为饲料资源开发的潜力。桑树作为我国本土树种，具有适应性强，成园成本低廉，栽培技术成熟、病虫害少等特点，利用非耕地发展饲料桑对保证我国粮食安全具有重要意义。

关于桑叶在畜禽水产饲料上的应用研究主要集中在其添加量的优化、添加后对动物生理指标、生产指标、畜禽水产品品质评价方面[2]。有研究表明，饲料中添加适量桑叶粉，可显著提高动物生产性能和自增重等，改善动物肉质品质，提高机体抗氧化能力和免疫力等[3]。目前桑叶最常用的饲用形式是直接鲜食或刈割后粉碎添加至动物的饲料中。但是采用这一方法饲喂畜禽，会出现添加量低、适口性差等问题。马恒甲等[4]发现，草鱼饲料中添加10%桑叶，草鱼的生长受到显著影响，日增重和生长率受到抑制。目前关于蛋鸡的研究表明，桑叶添加量超过一定比例后，蛋鸡产蛋率及采食量显著降低[5]。出现这种原因，猜测是由于桑叶中含有抗营养因子，影响动物的消化吸收。但目前关于桑叶中的主要抗营养因子和种类及综合评价桑叶的饲用价值的研究资料甚少。

本研究通过测定和分析桑叶的营养成分、瘤胃降解特性、氨基酸组成、抗营养因子种类和含量，同时与“牧草之王”苜蓿进行比较，客观地评价桑叶的饲用价值，为今后开展科学、合理对桑叶的培育、推广以及综合开发利用提供科学依据，有望弥补我国饲料蛋白源的不足。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 桑叶

桑叶为第5-10片成熟叶，桑品种为桐乡青，于2017年7月中旬随机采摘于重庆市蚕业科学研究院。试验材料采收后经65 ℃烘干后，粉碎机粉碎，过0.613 mm筛，置密封袋中冷冻保存。

1.2 试验动物及饲养管理

选用3头安装瘤胃瘘管、健康状况良好、体重为400 kg左右的云南云岭牛。每日基础饲粮供给量为维持营养需要水平的1.3倍，日粮精粗比为1∶9，精料组成：每1 kg精料中含米糠100 g、麦麸80 g、玉米460 g、豆粕40 g、菜粕120 g、棉粕25 g、酒糟粉70 g、大麦50 g、预混料20 g、小苏打5 g、盐15 g、油5 g。粗料：青贮玉米秸秆。试验于2017年10月在云南省草地动物科学研究院进行，预试期10 d，正试期3 d。试验期间，试验用牛圈养，分别于8:00和18:00饲喂，自由饮水，且进行免疫处理和驱虫处理，保证试验用牛的健康。

1.3 瘤胃降解率的试验设计

准确称取桑叶5 g装入常规尼龙袋中，每个时间点分别设有4个重复，将每一组绑在50 cm的半软质塑料管上，置于专用网袋中，按照规定，试验用牛晨饲后，将装有饲料的网袋放入肉牛瘤胃中，分别于放置瘤胃后的6、12、24、48及72 h后从瘤胃中取出，于室温下用水冲洗所有尼龙袋，并在65 ℃条件下烘至恒重储存待用，其中0时间点的桑叶样品仅做放入39 ℃热水中浸泡30 min处理，取出65 ℃烘干至恒重待用。

1.4 相关指标测定

1.4.1 营养成分测定

采用饲料常规分析法[6]测定桑叶干物质(dry matter, DM)、粗蛋白 (crude protein, CP)、粗脂肪(ether extract, EE)、粗纤维(crude fiber, CF)、粗灰分(crush ash, ASH)和有机物 (organic matter, OM)含量，采用范氏测定法[7]测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)，参照GB/T 6436-2018《饲料中钙的测定》采用高锰酸钾法测定钙含量，参照GB/T 6437-2002《饲料中总磷的测定》采用分光光度法测定磷含量。

1.4.2 水解氨基酸的测定

桑叶中氨基酸含量采用氨基酸自动分析法，参照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》。

1.4.3 抗营养因子测定

采用硝酸铝-亚硝酸钠法[8]测定桑叶中黄酮含量，苯酚-硫酸法[9]测定桑叶中多糖含量，高效液相色谱-紫外检测法[10]测定桑叶中DNJ含量，钨酸钠-磷钼酸盐比色法[11]测定桑叶中单宁含量，水杨酸铁络合比色法[12]测定桑叶中草酸含量；三氯化铁比色法[13]测定桑叶中植酸含量，香草醛-高氯酸比色法[14]测定桑叶中皂苷含量。

1.5 数据处理

1.5.1 饲料相对值

粗饲料分级标准[15]采用饲料相对值(relative feed value, RFV)[16]评定粗饲料质量，将粗饲料一共分为特级(＞1.51)、1级(1.25～1.50)、2级(1.03～1.24)、3 级 (0.87～1.02)、4 级 (0.75～0.86)和 5 级 (＜0.75) 6个等级，特级饲料价值最高，5级饲料价值最低。

RFV=DMI×DDM/1.29。

式中：DMI(%BM)表示动物对粗饲料干物质的自由摄入量，DMI(%BM)=120/NDF；DDM(%DM)表示粗饲料中的可消化干物质，DDM(%DM)=88.9-0.779×ADF。

1.5.2 瘤胃降解率

每个时间点饲料的瘤胃降解率(%)可通过以下公式计算：

每个时间点饲料样品中某一营养成分的降解率=[(饲料样品未放入瘤胃前某一营养成分含量-饲料样品从瘤胃中取出后某营养成分含量)/饲料样品未放入瘤胃前某一营养成分含量]×100%。

1.5.3 瘤胃降解参数

参考Φrskov和McDonald[17]提出的瘤胃动力学数学模型，参照下述公式计算：dp=a+b(1-e-ct)。

式中：dp为t时的降解率，a为快速降解部分(%)，b为慢速降解部分(%)，c为慢速降解部分的降解速率常数(h-1)，t为饲料在瘤胃内的培养时间(h)。

粗饲料有效降解率(effective degradation, ED, %)：ED=a+b×c/(k+c)，其中k表示粗饲料被后反刍动物摄入，其在瘤胃中的流通速率，试验条件下k取0.031/h。

1.5.4 氨基酸的评价

1)模糊识别法[18]

根据兰氏距离法计算样品蛋白的贴近度μ(a,u1)，计算方法如下：

式中：ak表示标准蛋白中各种必需氨基酸的含量，uik表示第i个待测样品蛋白的第k个必需氨基酸的含量。

贴近度μ数值越大，表明待测样品蛋白中氨基酸的平衡性越接近于标准蛋白，说明与动物的需要量越贴切，该待测样品具有更高的饲用价值。

2)氨基酸比值系数法

由氨基酸平衡理论及FAO/WHO必需氨基酸模式[19]，计算待测样品蛋白的氨基酸比值(ratio of amino acid, RAA)、氨基酸比值系数(ratio coefficient of amino acid, RCAA)及比值系数分(score of ratio coefficient of amino acid, SRCAA)，按下述公式进行计算:

式中：CV(coefficient of variation)表示RC的变异程度，CV=标准偏差/平均数值。

1.6 数据整理与统计分析

采用EXCEL 2013 和SPSS 21.0软件对试验结果进行统计，结果用平均数 ± 标准差(±s)来表示。

2 结果与分析

2.1 桑叶的营养成分

桑叶的粗蛋白、粗脂肪和粗纤维含量分别为22.50%、2.20%和13.52% (表1)，钙和磷含量分别为2.42%和5.65%。

2.2 桑叶各营养成分在肉牛瘤胃中不同时间点的降解率及有效降解率

桑叶各营养成分在肉牛瘤胃中的降解率具有相同趋势 (表2)，即随其在瘤胃中时间的延长而逐渐增大，于72 h时降解率最大，其中CP、OM、DM的降解率均达到90%左右，接近于完全降解，而ADF、NDF的降解率分别为77.75%、85.69%，降解率相对较低。12 h时，各营养物质降解率均未达到72 h时最大降解率的一半，24 h时，各营养物质降解率均达到72 h时最大降解率的70%以上，12-36 h，CP、NDF和OM降解率变化较大(P＜0.05)，所有指标48 h及以后降解率趋于稳定(P＞0.05)，可以看出，桑叶各营养成分在瘤胃中的降解点是12 h，各营养成分在36 h基本降解完成，其降解速率较快。桑叶中各营养物质的有效降解率分别为CP 65.02%、OM 59.42%、DM 58.56%、ADF 48.39%和NDF 56.42%。

表1 桑叶的营养水平(干物质基础)Table 1 The nutrient levels in mulberry leaves (DM basis)

表2 桑叶中各营养成分的瘤胃动态降解率及有效降解率Table 2 The ruminal degradability and effective degradation rate of different nutritional components in mulberry leaves

2.3 桑叶蛋白的氨基酸组成

对桑叶蛋白中所含的氨基酸种类及含量采用氨基酸自动测定法测定，检测指标中包括的17种氨基酸桑叶中均可以检测到，其中包括7种动物机体的必需氨基酸(essential amino acid, EAA) (表3)。桑叶蛋白中含有的氨基酸含量为144.1 mg·g-1，其中EAA含量为61.5 mg·g-1，在总氨基酸中所占比例为42.7%，EAA与非必需氨基酸(non-essential amino acid, NEAA)的比值达到0.746，桑叶蛋白中氨基酸含量在0.13%～1.76%，其中谷氨酸和天冬氨酸的量最大，分别占总量的14.8%和19.1%。

2.4 桑叶蛋白的平衡性分析

2.4.1 模糊识别法的评价结果

由模糊识别法计算得出桑叶蛋白贴近度u1为0.524，说明桑叶蛋白与标准蛋白的贴近度较高。

2.4.2 氨基酸比值系数法的评价结果

在桑叶蛋白中，赖氨酸的RAA值最低，仅为0.04，说明其为第一限制性氨基酸(表4)。将桑叶蛋白与标准模式蛋白进行氨基酸组分对比发现，桑叶蛋白与标准模式蛋白差异性不大，含量最高的氨基酸为苏氨酸，RAA值为0.26。

2.5 桑叶的抗营养因子

经测定，桑多糖含量为159.33 mg·g-1，黄酮、单宁和皂苷含量分别为31.75、19.95和14.50 mg·g-1，DNJ和植酸含量分别为1.63和3.75 mg·g-1，草酸含量最低，仅为 0.27 mg·g-1(表5)。

表3 桑叶蛋白的氨基酸含量Table 3 Amino acid content of mulberry leaves

表4 桑叶蛋白的氨基酸比值系数分数值Table 4 Amino acid ratio coefficients of proteins from mulberry leaves

3 讨论

3.1 桑叶的营养价值评价

评判饲料营养价值的基础是对饲料中的营养物质进行常规的化学分析，这也是后续采用尼龙袋半体内法测定饲料在肉牛瘤胃中降解率的前提。与苜蓿[20]相比，桑叶具有粗蛋白含量、RFV值高，酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维含量较低的特点，说明桑叶属于蛋白质饲料[21]，具有较高的营养价值。

3.2 桑叶的瘤胃降解特性

评判粗饲料的营养价值由某一单个因素(如粗饲料的常规营养成分)决定具有很大的片面性，动物机体对粗饲料中各种物质的摄入量及消化利用程度是评价粗饲料营养特性的又一重要因子，可通过饲料的降解特性反映饲料消化率的高低[22]，综合两个因素更能够全面地评价粗饲料的营养价值。

3.2.1 桑叶粗蛋白的降解特性

在所有评价粗饲料营养价值的指标中，CP的参考意义较高，动物对粗饲料中CP的消化利用程度可以直接反映动物机体中瘤胃微生物蛋白的合成情况及体内氮元素的聚集情况，CP的降解率主要由粗饲料自动物摄入后在瘤胃中的停留时间及饲料发酵的难易程度所决定[23]。本研究中，桑叶CP的有效降解率高于50%，但低于苜蓿(77.94)[20]，表明桑叶具有提高动物品质的功能，但略低于苜蓿。

3.2.2 桑叶中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的降解特性

NDF、ADF降解率是评价反刍动物对粗饲料中营养物质利用的重要指标，NDF降解率可准确反映动物对粗饲料中纤维的利用率。NDF、ADF及日粮组分是影响饲料中NDF、ADF降解率的主要原因，从而能够影响NDF和ADF的瘤胃有效降解率[24]。ADF是粗饲料中消化率最低的成分，主要包括木质素(ADL)纤维素及二氧化硅等，因木质素结构特殊，瘤胃微生物对其降解率较低，故瘤胃微生物对粗饲料中ADF的降解率一般不高[25]。本研究中桑叶的NDF和ADF的最终降解率及有效降解率均低于其他3种营养物质，与苜蓿（Medicago sativa）[20]相比，桑叶的有效降解率显著高于苜蓿(NDF、ADF的有效降解率分别为26.47%和26.14%)，这些结果说明桑叶中NDF和ADF比较利于动物的消化吸收。

表5 桑叶中的抗营养因子含量(干物质基础)Table 5 Anti-nutrient levels of mulberry leaves (DM basis)

3.2.3 桑叶干物质、有机物的降解特性

饲料中DM和OM的降解速率可以直接影响和说明反刍动物在一定的时间内对饲料干物质的总摄入量，DM和OM的有效降解率越高，反刍类动物对粗饲料的采食量越高及对粗饲料的消化利用程度越高，更有利于动物的生长育肥[26]。桑叶的DM和OM的有效降解率高于苜蓿(DM和OM的有效降解率分别为56.24%和53.15%)[20]，说明肉牛瘤胃内微生物能更好地利用桑叶中的营养物质，且桑叶更有利于反刍类动物的生长育肥。

3.3 桑叶蛋白的氨基酸组成

粗蛋白的营养价值与其氨基酸组成密切相关，特别是必需氨基酸的含量和比例[27]。本研究测得，桑叶蛋白中EAA/TAA和EAA/NEAA值均高于FAO/WHO标准所规定的最小值(0.4和0.6)[19]，EAA/TAA和EAA/NEAA与苜蓿(0.435和0.771)接近，且桑叶蛋白中含有动物机体所需的全部种类的氨基酸，氨基酸含量也满足动物的需求，必需氨基酸含量较高，表明桑叶属于优质蛋白源[28]。

3.4 桑叶蛋白的平衡性分析

3.4.1 模糊识别法评价桑叶蛋白

模糊识别法是评价待测蛋白与标准蛋白中各种氨基酸的接近程度，数值越大，表明待测蛋白中氨基酸与标准蛋白差异性越小，则待测蛋白中氨基酸品质越好[29]。桑叶蛋白与标准蛋白的贴近度差值大于0.5，这说明桑叶蛋白中氨基酸品质较高。

3.4.2 氨基酸比值系数法分析桑叶蛋白中氨基酸的平衡性

必需氨基酸的种类、含量及组成平衡性是影响粗饲料中蛋白质品质的主要因素，其中必需氨基酸的平衡性与FAO/WHO氨基酸模式越接近，表明该饲料蛋白品质越好，能够提供动物机体的营养需求[30]，故世界卫生组织和联合国粮农组织于20世纪70年代提出一个全新的方法——氨基酸比值系数法来评价某种粗饲料中蛋白的品质高低[30]。氨基酸的吸收过程之间彼此影响，其中限制性氨基酸是影响蛋白质营养价值的主要原因。桑叶中的第一限制性氨基酸为赖氨酸，在使用过程中应注意与其他叶蛋白或富含赖氨酸的蛋白质混合使用，提高桑叶蛋白质的利用率及营养价值。

3.5 桑叶中的抗营养因子

抗营养因子是植物在代谢过程产生，以不同形式对机体吸收营养物质产生拮抗作用的物质，目前研究较多的有单宁、草酸、植酸、生物碱、皂苷等[31]。

桑叶中活性物质较多，其中具有强α-糖苷酶抑制活性的物质有桑黄酮、桑多糖和1-脱氧野尻霉素，并且这3类物质相互作用，共同抑制α-糖苷酶活性。张鸿等[32]研究发现，桑树中这3类物质会显著影响动物机体中葡萄糖和糖原等碳水化合物在体内的一系列生化反应，当动物摄入体内的碳水化合物因肠粘膜细胞中缺乏相应的营养物质水解酶导致其吸收率降低甚至为零时，会出现肠道内容物的渗透压高于正常水平的情况，这时需吸收大量的水分而导致动物出现腹泻现象，故具有一定的抗营养特性。目前的研究表明，植物中桑是DNJ最主要的来源，故在桑叶利用时尤其需注意DNJ的抗营养特性。

本研究测得桑叶中单宁含量为19.95 mg·g-1，高于高粱 (Sorghum bicolor, 10.50 mg·g-1)[33]和苜蓿(10.03 mg·g-1)[34]。饲料中单宁经动物口腔咀嚼后与口腔中的糖蛋白作用，生成影响动物适口性的苦味和涩味物质；与金属离子、蛋白质、多糖等物质结合，从而降低动物对营养物质的吸收与利用；还会抑制消化酶的活性，降低大部分营养物质的消化率，尤其是蛋白质和碳水化合物[35]，Donnelly和Anthony[36]发现，对食草动物而言，单宁含量达2%干物质时，可产生明显的阻食现象。桑叶使用时应注意单宁的影响。

饲料中的皂苷与动物口腔中的蛋白酶作用后，分解为具有苦味、涩味和辛辣味的小分子物质，导致动物出现适口性降低的情况，进而影响动物对饲料中营养物质的摄入量，生长速率降低，皂苷还具有溶血活性，引起红细胞溶血，且会引起反刍动物的瘤胃鼓气[37]。桑叶中皂苷含量高于苜蓿(8.79 mg·g-1)[34]，且高于魏伯平等[38]分析的9种豆科牧草中皂苷含量最高的紫云英(Astragalus sinicus, 12.65 mg·g-1)，故桑叶作为饲料时应注意皂苷对动物生长性能的影响。

植酸与饲料中的矿物元素结合为不溶性复合物，降低肠道对植酸的吸收，还与蛋白、淀粉等营养成分结合，阻碍动物对营养成分的利用[39]。与吴德锦[34]测定的粗茎象草(Pennisetum purpureum)和细茎象草中植酸含量接近，但极显著低于苜蓿含量(11.26 mg·g-1)，桑叶中的植酸可能对日粮中的大量添加有限制作用。

Hang等[40]发现草酸和草酸盐会影响矿物元素的利用，是饲料作物中的一种抗营养因子。草酸影响动物对矿物元素的利用，草酸与日粮中的Ca结合，形成草酸钙，干扰Ca、P的新陈代谢，包括骨中矿物元素的代谢，骨骼中矿物质的消耗使骨骼纤维化和畸形化，造成动物残疾。一般当水溶性草酸含量在达到约2%时才会严重影响反刍动物的健康[34]，桑叶中草酸远低于2%，其抗营养特性不明显。

4 结论

桑叶CP含量高于20%，属于蛋白质饲料，其饲料相对等级属于特级，且桑叶中各营养成分在肉牛瘤胃中的72 h时基本接近完全降解，各营养成分的有效降解率分别达到CP 65.02%、ADF 48.39%、NDF 56.42%、DM 58.56%、OM 59.42%，在肉牛瘤胃中，桑叶的消化率高，综上，桑叶饲用营养价值较高。

桑叶蛋白中含有被检测的17种氨基酸，EAA/TEAA为0.427，EAA/NEAA为0.746，但桑叶蛋白与标准蛋白的贴近度仅为0.524，SRCAA值仅为65.02，桑叶蛋白中RAA值最小的为赖氨酸(0.04)，说明桑叶蛋白中含有的氨基酸种类完整，包括动物需要的所有种类的氨基酸，且其中氨基酸的含量相对较高，能够满足动物的最低要求，但是其营养价值并不能归于高营养价值一类。赖氨酸是桑叶中的第一限制性氨基酸，且桑叶中含有多种抗营养因子。鉴于桑叶中存在氨基酸不均衡和抗营养因子的问题，在桑叶应用时，应进行氨基酸的平衡及抗营养因子的钝化，以提高桑叶蛋白质的利用率及营养价值。