三种冷冻方法对胎儿卵巢组织凋亡相关蛋白表达的Bcl-2、Bax、Caspase影响

王国平 李倩倩 王燕蓉

（1 宁夏医科大学组织学与胚胎学教研室，宁夏回族自治区生殖与遗传重点实验室，宁夏 银川 750004；2 宁夏银川市妇幼保健院，宁夏 银川 750001；3 宁夏医科大学附属总院消化内科，宁夏 银川 750004）

目前冻存卵巢组织的冷冻方法有程序冷冻法、快速冷冻法、玻璃化冷冻法，三种方法是否存在低温诱导卵泡凋亡，Bcl-2家族是否在低温诱导卵泡凋亡中发挥调控作用，目前国内尚未见报道。为观察不同冷冻方法所致凋亡程度的大小，本研究观察了Bcl-2、Bax及Caspase-3在冷冻后的卵巢内早期卵泡的表达，并以此作为卵巢冻存后损伤程度的检测方法，评价不同冷冻方案的冷冻效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 胎儿卵巢的获取：本研究获医学伦理委员会同意。征得家属同意，胎儿卵巢取自20～28周引产的死亡女胎，将卵巢皮质切成2 mm×2 mm×1 mm大小的皮质块备用。

1.1.2 卵巢冻存实验分组：①新鲜对照组（fresh control group，FCG）；②程序法冷冻组（program freezing group，PFG）；③快速法冷冻组（rapid freezing group，RFG）；④玻璃化法冷冻组（vitrification group，VG）。

1.1.3 实验用液体：①冷冻保护液：A组液体（用于程序冷冻法和快速冷冻法）；B组液体（用于玻璃化冷冻法）。②解冻液：A组液体（用于程序冷冻法和快速冷冻法）；B组液体（用于玻璃化冷冻法）。

1.2 方法

1.2.1 冷冻及解冻方法：①程序冷冻法：冷冻程式参照Oktay等提出的慢冻-速融方法[1]。②快速冷冻法：采用本实验室摸索出的程序进行[2]。③程序冷冻法与快速冷冻法的解冻方法 参照Shaw氏法[3]。④玻璃化冷冻、解冻法：采用本实验室摸索出的程序进行[4]。

1.2.2 Bcl-2、Bax、Caspase-3 免疫组织化学检测：一抗为兔抗人Bcl-2/Bax/Caspase-3单克隆抗体，二抗为山羊抗兔IgG。采用免疫组化SABC法，阴性对照以PBS 代替一抗。操作步骤严格按说明书进行。

1.3 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白阳性表达卵泡判断标准：高倍视野下，卵细胞胞质内出现棕色颗粒或≥2个颗粒细胞出现棕色颗粒，视为Bcl-2、Bax或Caspase-3蛋白阳性表达卵泡，每张切片随机取5个高倍视野，计数阳性卵泡数量和总卵泡数，得出Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白阳性表达卵泡百分率。

1.4 统计学方法：用SPSS 11.0进行统计学处理，各指标数值均采用均数±标准差表示（），Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白阳性表达卵泡百分率比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Bcl-2、Bax蛋白表达：新鲜组及冷冻各组Bcl-2、Bax蛋白主要在始基卵泡内的卵母细胞胞质中呈不同程度表达，偶见卵泡细胞表达。新鲜组、玻璃化冷冻组Bcl-2/Bax比值＞1；程序冷冻组、快速冷冻组Bcl-2/Bax比值＜1。

2.1.1 Bcl-2蛋白表达：三种方法冷冻后卵泡内Bcl-2蛋白阳性表达率较冷冻前下降，与新鲜组均有显著性差异（P＜0.05）。

2.1.2 Bax蛋白表达：冻后卵泡内Bax蛋白阳性表达率显著上升，快速冷冻组Bax蛋白阳性表达率显著高于新鲜组，P＜0.001。程序冷冻组、玻璃化冷冻组虽高于新鲜组，但无显著性差异（P＞0.05）。

2.2 Caspase-3蛋白表达：新鲜组及冷冻各组Caspase-3蛋白主要在始基卵泡内的卵泡细胞胞质中呈不同程度表达，冻后卵泡内Caspase-3蛋白阳性表达率上升，除玻璃化冷冻组与新鲜组无显著性差异外（P＞0.05），其他两个冷冻组与新鲜组均有显著性差异（P＜0.05），见表1。

表1 各组卵泡冷冻前后蛋白阳性表达率的变化（）

表1 各组卵泡冷冻前后蛋白阳性表达率的变化（）

注：*：与其他组相比，P＜0.01；**：与其他组相比，P＜0.001；***：与其他组相比，P＜0.001；▲：与PFG组相比，P＜0.05

3 讨 论

卵巢内细胞凋亡是一种受各种机制调控的程序化细胞死亡。越来越多的研究显示，在卵泡的凋亡调控中，以Bcl-2蛋白家族为代表的一组凋亡调节蛋白起着极为重要的作用。本研究结果显示：冷冻后的Bax 蛋白表达较冷冻前明显上升，Bcl-2蛋白表达在卵巢冷冻后则显著下降，且Bax、Bcl-2表达趋势与Caspase-3表达相一致，即随Bcl-2表达降低，Bax表达升高，Caspase-3表达也增加，表明冷冻过程影响了细胞凋亡过程。刘子明等认为若Bcl-2/ Bax 比值＞1，细胞趋于存活；反之若Bcl-2/ Bax 比值＜1，则细胞趋向发生凋亡[5]。本研究发现：强表达Bax蛋白的PFG组、RFG组早期卵泡，Bcl-2蛋白弱表达或者不表达；反之，Bcl-2蛋白强表达的VG组早期卵泡，Bax蛋白弱表达或者不表达。统计结果显示：PFG组、RFG组 Bcl-2/ Bax 比值＜1，Caspase-3表达阳性率高，单位体积卵巢皮质块所保存的卵泡数少，而Bcl-2/ Bax比值＞1的VG组，Caspase-3表达阳性率低，单位体积卵巢皮质块所保存的卵泡数多。这在一定程度上也证实VG组的冷冻效果好于PFG组与RFG组，与组织形态学观察结果相一致[6]。分析原因可能是方法欠佳的冻存由于保护剂的毒性作用或冰晶的破坏导致细胞Bcl-2、Bax的表达失常，Bcl-2的表达下降，Bax的表达增强导致卵泡凋亡过程的启动，活化了Caspase-3，细胞发生凋亡。

另有研究显示：冷冻复温的过程主要破坏卵泡中的颗粒细胞，而对卵母细胞的损伤很小[7]。其原因可能与卵母细胞位于卵泡的中间，代谢低，细胞器少，缺乏皮质颗粒，周围有颗粒细胞的保护，所以容易存活。而颗粒细胞位于卵泡的外层，最早接触冷冻保护剂以及感受外界环境的变化，损伤较卵母细胞严重[8]。颗粒细胞具有重要的作用，其增殖与分化既是始基卵泡启动的重要前提，又为生长期卵泡的进一步发育成熟提供必要的营养与信息支持。在我们的实验中发现，Bcl-2、Bax均在卵母细胞胞质内表达，而Caspase-3则在颗粒细胞上表达。我们推测深低温冷冻可能是通过上调Bax基因的表达，下调Bcl-2基因的表达，通过线粒体介导的细胞内途径最终导致颗粒细胞内Caspase-3活化，最终使胎儿卵巢内早期卵泡通过细胞内凋亡途径趋向死亡。

综上所述，玻璃化冻存法可有效冻存胎儿卵巢组织。不同冷冻方法均导致了Bcl-2表达的下降和Bax及Caspase-3表达的增加，冷冻所诱导的卵泡凋亡参与了卵泡的后续丢失。

研究冻存和融解过程中细胞损伤机制，对卵泡在冷冻损伤中的凋亡事件进行探讨，可以透过微细构造变化的观察找出卵巢经冷冻保存系列步骤中可能造成伤害的原因，并判断冷冻保存过程中细胞受损伤状况，若能进一步找出减轻或解决损伤的方法，将有助于提高卵巢深低温保存的存活率。