柱前衍生高效液相色谱法测定中韩泡菜中的氨基酸含量

贾载凯，毛新刚，苏晓岚，张 云，洒荣波

（1.山东第一医科大学（山东省医学科学院） 生命科学学院，山东泰安 271000；2.泰安市疾病预防控制中心，山东泰安 271000）

泡菜是中国、韩国等亚洲国家传统发酵蔬菜食品，是以新鲜蔬菜为原料，在多种微生物作用下经盐水泡制而成的发酵蔬菜[1]。泡菜风味独特、鲜酸可口、质地脆嫩、营养丰富，具有增加食欲、促进消化、解腻开胃的作用，经常食用具有延年益寿、预防癌症等功效[2]。中国泡菜的杰出代表传统四川泡菜已有1 700多年的历史，以新鲜蔬菜为主要原料，将发酵原料浸泡在密闭的容器中，不添加过多的调味料[3]。韩国泡菜以大白菜等各种蔬菜为主要原料，调料丰富多样且配比合理，以腌渍式进行兼性厌氧型的发酵过程[4]。无论中国泡菜还是韩国泡菜，风味是其中的一项重要指标。泡菜的风味物质包括有机酸[5]、氨基酸[6]、挥发性风味物质[7]等。

目前，氨基酸的检测主要采用氨基酸分析仪和液相色谱仪等手段，氨基酸分析仪检测氨基酸虽然快速、准确，但由于仪器昂贵，且运行成本高不具有普遍性[8]。近年来，柱前衍生化液相色谱法检测氨基酸得到了更加普遍的应用。检测氨基酸常用的衍生试剂主要有芴甲氧羰酰氯（FMOC-CL）、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）、异硫氰酸苯酯（PITC）及邻苯二甲醛（OPA）等。其中，使用PITC对氨基酸进行衍生具有操作简单、产物稳定、反应迅速等优点，已成为一种经典的氨基酸衍生方法[9]。试验建立了一种柱前衍生化HPLC方法快速检测中韩泡菜中的游离氨基酸种类和含量，以期为中韩泡菜风味物质的来源研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

中国泡菜，购自四川味之源食品有限公司；韩国泡菜，购自香港进口韩国泡菜代理清关公司。

17种氨基酸混合标样：天门冬氨酸（Asp）、谷氨酸 （Glu）、丝氨酸 （Ser）、甘氨酸 （Gly）、组氨（His）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys），17种氨基酸的浓度均为2.5 mmol/L，购自美国沃特世公司；乙腈（色谱纯），购自德国默克公司；异硫氰酸苯酯、乙酸钠、正己烷等，均为国产分析纯试剂。

安捷伦1200型高效液相色谱仪，可以使用二元、三元和四元梯度；安捷伦1200型二极管阵列检测器；Milli-Q型超纯水制备机。

1.2 试剂配制

（1） 异硫氰酸苯酯乙腈溶液（0.1 mol/L）：准确移取120μL异硫氰酸苯酯溶液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

（2） 三乙胺乙腈溶液 （1 mol/L）：准确移取1.398 mL三乙胺至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

（3） 乙酸钠缓冲盐溶液：准确称量2.72 g三水乙酸钠，溶解于1 000 mL水中，充分混合后，用0.45μm水相滤膜过滤，超声处理后备用。

1.3 样品预处理

取10 g泡菜于80℃下烘干后加石英砂研磨，溶于50 mL去离子水超声处理30 min后离心取上清液待衍生化处理。

1.4 样品衍生化

向2 mL离心管中加入氨基酸混合标样或泡菜样品（过0.45μm滤膜）50μL和150μL超纯水，再加入异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL和三乙胺乙腈溶液100μL后振荡混匀。静置1 h后加入正己烷400μL，充分振荡后静置10 min，待溶液分层后取下层溶液经0.45μm滤膜过滤后进行HPLC分析。

1.5 色谱条件

色谱柱使用美国SMA氨基酸分析柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相A为乙酸钠缓冲液-乙腈（97∶3，V/V），流动相B为乙腈-水（4∶1，V/V），流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温30℃，进样量10μL，设计梯度洗脱程序。

梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.6 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，每组进行3次平行试验，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 氨基酸标样的定性

采用Agilent TC-C18柱、Ultimate XB C-18、ODS通用柱和美国SMA氨基酸专用分析柱对氨基酸标样中的17种氨基酸进行检测，发现使用美国SMA氨基酸专用分析柱检测可以使氨基酸标样中的17种氨基酸达到基线分离，17种氨基酸色谱峰的分离度均大于1.5，在选定的分离条件下，其分离效果和稳定性最好。所有的氨基酸在35 min内即全部出峰，相对于其他氨基酸检测的报道，试验的检测方法更具有检测时间上的优势。

17种氨基酸混合标样高效液相色谱图见图1。

2.2 氨基酸检测标准曲线和检测方法的检测限

将氨基酸混和标准溶液（2.5 mmol/L） 按2倍梯度逐渐稀释至0.01 mmol/L，按照上述的色谱条件进行紫外检测，以各氨基酸色谱峰峰面积（Y）对氨基酸浓度（X） 进行回归分析，得到线性回归方程。结果表明，除天冬氨酸和谷氨酸检测标准曲线的线性范围较窄外（分别为0.08～2.50 mmol/L和0.16～2.50 mmol/L），其他氨基酸基本在0.02～2.50 mmol/L范围内均具有较好的线性关系，所有氨基酸的标准曲线在设定的线性范围内的相关系数均≥0.99。

图1 17种氨基酸混合标样高效液相色谱图

17种氨基酸的线性回归方程、检测限和分离度见表2。

2.3 中韩泡菜氨基酸种类和含量的测定

中国泡菜中氨基酸高效液相色谱图见图2，韩国泡菜中氨基酸高效液相色谱图见图3。

图2 中国泡菜中氨基酸高效液相色谱图

表2 17种氨基酸的线性回归方程、检测限和分离度

图3 韩国泡菜中氨基酸高效液相色谱图

从氨基酸种类来看，中国泡菜中的游离氨基酸种类比韩国泡菜要少，中国泡菜中没有酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸，其他14种氨基酸均存在；韩国泡菜中除了没有蛋氨酸以外，其他16种氨基酸均存在。从氨基酸含量来看，中国泡菜中的各种氨基酸含量均远大于韩国泡菜，其中中国泡菜中的天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和甘氨酸含量比韩国泡菜高出1倍左右，而苯丙氨酸含量比韩国泡菜高出近8倍；中国泡菜中的总氨基酸含量（12 204.19μg/g泡菜）远高于韩国泡菜中的总氨基酸含量（5 275.27μg/g泡菜），前者为后者的2.3倍。

样品中氨基酸检测结果见表3。

表3 样品中氨基酸检测结果

2.3 加样回收率和精密度试验

对中国泡菜样品进行2个水平（半量、等量）的加标试验，平行测定3次，平均加标回收率在79.5%～94.7%，相对标准偏差为1.23%～5.76%，可以满足泡菜中氨基酸含量测定的要求。

2.4 重复性试验

将17种氨基酸混合标样在试验的检测条件下连续进样3次，考查检测方法的重复性。结果显示17种氨基酸的峰面积的相对标准偏差RSD为0.2%～0.7%。

3 结论

建立了一种快速有效的检测中国泡菜和韩国泡菜中的游离氨基酸含量的方法，经PITC衍生后，17种氨基酸在36 min以内均得到了基线分离，检测时间优于已经报道的文献中氨基酸的检测时间。利用此方法对中国泡菜和韩国泡菜中的游离氨基酸种类和含量进行了检测，结果发现中国泡菜中的氨基酸种类比韩国泡菜要少，但中国泡菜中的氨基酸含量，尤其是呈味氨基酸，均远大于韩国泡菜。

样品中氨基酸的风味分析见图4。

氨基酸按照呈味特征可以分为4类：甜味氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、脯氨酸和蛋氨酸），苦味氨基酸（缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸），鲜味氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸），涩味氨基酸（酪氨酸）。从呈味特征方面对中韩泡菜中的氨基酸组成进行分析，从图4中可以看出，对中国泡菜而言，甜味氨基酸是最主要的氨基酸，占氨基酸总量的50%，其次是苦味氨基酸，占到总氨基酸的46%，鲜味氨基酸只占3%，在中国泡菜中没有发现涩味氨基酸。而对韩国泡菜而言，苦味氨基酸是最主要的氨基酸成分，占氨基酸总量的51%，甜味氨基酸次之，占比为37%；鲜味氨基酸和涩味氨基酸分别占氨基酸总量的3%和6%。

风味是泡菜的一个主要品质指标[10]，通过对风味物质的检测和定量分析，可以为泡菜加工工业的品质控制及工艺改进提供依据[11]。氨基酸作为泡菜中非常重要的一类风味物质，其快速和准确的检测方法，一直是人们研究的一个重点和热点。试验为中韩泡菜风味物质的来源研究提供了理论依据，值得泡菜加工企业借鉴。