酸奶中葡糖杆菌的快速分子检测

摘 要：葡糖杆菌是污染酸奶的常见菌种，随着人们健康意识的提高，酸奶的安全问题越来越受到人们的关注和重视。本文通过聚合酶链式反应验证引物的可行性及灵敏度后，使用凝胶成像分析系统进行图像分析，以快速检测酸奶中的葡糖杆菌。

关键词：关键词葡糖杆菌;聚合酶链式反应;凝胶成像分析系统

中图分类号：S-3文献标识码：A DOI：10.19754/j.nyyjs.20191030009

1 引言

酸奶对人体的营养价值受到大众越来越多的关注[1-2]，然而微生物代谢、繁衍极易引起酸奶的腐败变质[3-4]，酸奶遭到微生物毒害而引发食物中毒的事件在全球屡见不鲜。葡糖杆菌属于醋酸菌科[5]，并且是较早发现且研究的菌属，其可导致酸奶腐败变质。分子生物学手段中的PCR技术目前受到越来越多的重视[6-8]，使得酸奶中微生物的检查变得更加精准[9-10]，本文以葡糖杆菌为检测目标，通过PCR后的电泳成像来判断酸奶中受葡糖杆菌污染的程度。

2 材料与方法

2.1 材料

葡糖杆菌属来源于山西农业大学信息学院微生物实验室;PCR引物、DNA Maker、Goldeen view、琼脂糖、电泳缓冲液、提取缓冲液购自生工公司。

2.2 方法

2.2.1 引物设计

根据NCBI网站查找的葡糖杆菌16S rDNA特异基因序列，通过生物信息学网站Primer3 Input设计引物，上游引物：CTCAGTGTCGAAGCTAACGC;下游引物：GAGGTCCGAAGAAAGGTCCA，扩增长度1478bp。

2.2.2 扩增方法

3 结果与分析

3.1 基因组纯度检验

通过基因试剂盒进行葡糖杆菌菌株的基因提取，酸奶中葡糖杆菌基因利用酶解法提取，提取的DNA进行OD260/OD280检测，以鉴定DNA纯度，如表3。经测定提取的DNA基因组的值均在1.8左右，说明DNA纯度良好。

3.2 引物特异性检验

以自制灭菌纯酸奶、纯种葡糖杆菌和接种葡糖杆菌的酸奶为模版，进行PCR扩增及电泳检测，结果如图1。实验设置空白对照组，对照组未添加任何DNA模板，结果显示对照组无条带，表明本体系无外源DNA的干扰。

3.3 引物特异性检验

为检验本PCR体系的检验精度，本实验进行人为污染设置，即将不同浓度的葡糖杆菌接种于未污染的酸奶中，最终得到葡糖杆菌浓度为3×105CFU/mL、2×105CFU/mL、1×105CFU/mL、0.5×105CFU/mL、0.1×105CFU/mL五种不同浓度的葡糖杆菌接种的1-5号样品。

2：自制纯酸奶3：人工接种葡糖杆菌的酸奶

分别将具有不同葡糖杆菌浓度的酸奶提取的DNA，以总基因为模版，运用PCR技术及胶体电泳检测，如图2。PCR结果显示，随着样品中葡糖杆菌含量的减少，PCR扩增条带亮度依次减弱，表明引物灵敏，且能检测浓度为0.5×105CFU/mL以上的葡糖杆菌含量。

3.4 酸奶放置时间对葡糖杆菌含量的影响

本实验选取灭菌的自制酸奶，开盖放置在室内，在放置0h、4h、8h、16h、24h后取样， 提取样品的全基因组，进行PCR扩增及电泳检测，结果如图3。结果表明随开盖时间的增加，酸奶中葡糖杆菌的数量也在增大，酸奶开盖之后为了保证饮用安全，需尽快饮用。[LL]

4 结论

随着人们安全意识的提高，酸奶的安全性问题越来越受到人们的重视，建立一种及时有效的检测酸奶中葡糖杆菌对消费者具有重要的意义。本文表明采用PCR方法可快速检测酸奶中葡糖杆菌，操作简便、直接、节省样本。

参考文献

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作者简介：

赵丹（1986-），男，讲师。研究方向：生物化学与分子生物学。