樟树籽仁油对非酒精性脂肪肝病小鼠肝脂及肝功能的研究

罗松 甘阳 蔡英傲 马浩鑫 朱桂达 王报贵

摘  要：目的 观察樟树籽仁油对非酒精性脂肪肝病（NAFLD）模型小鼠肝脂及肝功能的影响，探讨其相关作用机制。方法10 只实验小鼠随机分为正常组2只和肝脂变模型组8只，模型组小鼠给予MCD饲料喂养6w成功构建NAFLD模型，将模型小鼠分为 4 组：自然恢复组、樟树籽仁油组、猪油组、大豆油组，分别灌胃磷酸盐缓冲液、樟树籽仁油、猪油、大豆油，200 μL/只，周期4w，实验全程均自由摄食基础饲料和水。结果 与正常组比较，模型组小鼠行动迟缓，活动量减少，体重降低，粪便具有明显的油腻感，并且肝脏均呈现淡黄色;与模型组比较，樟树籽仁油组肝脏甘油三酯、胆固醇含量均显著降低。肝脏指数及组织病理学分析显示樟树籽仁油可以抑制肝脏脂肪沉积。结论 樟树籽仁油能够有效降低NAFLD小鼠肝脂水平，有利于肝功能的恢复，具有保护肝脏的作用，为该疾病的患者提供了一种膳食用油参考。

关键词：樟树籽仁油;非酒精性脂肪肝病;肝脂;肝功能

引 言

樟树作为我国特产珍贵经济林树种[1]，不仅具有较好的绿化价值，而且含有丰富的天然樟脑和芳香油等药用物质，具有极高的药用价值，但是并未对果实中所含的油脂进行开发和合理的利用，使物不能尽其用，造成资源浪费。早期研究发现樟树籽中含油率高达 40%以上，所含脂肪酸种类主要有：辛酸、癸酸、月桂酸等[2]。随着研究的逐步深入，发现与一般植物油不同的是，樟树籽仁油中癸酸（C10）和月桂酸（C12）含量相对较高，约占90%以上，属于天然中碳链油脂资源，所以可利用樟树籽仁油合成功能性油脂——中碳链甘油三酯及其衍生物[3-5]。国内外相关动物实验研究表明，饮食中添加中碳链甘油三酯 可以增加热能，减少脂肪沉积[6]。中碳链甘油三酯既具有给食品提供能量和营养的作用，又不影响食品风味[7]，并且具有奇特的代谢方式和特定的保健作用，因此近年来备受青睐。其奇特的代谢方式是因为中碳链甘油三酯经机体分解后成为中链脂肪酸[8]，因为碳链较短并且不依赖于肉毒碱转运蛋白的运输，所以氧化迅速且不易在脂肪组织和肝脏组织中蓄积，因其代谢速率快于长碳链甘油三酯，不易再合成甘油三酯，所以不易在肝脏中沉积，对肝脏代谢的压力减轻[9]。中碳链甘油三酯作为食品中天然存在的成分，中链脂肪酸在脂质代谢方面的优势使其成为最近研究的焦点。

以肝细胞脂质过多为特点的连续性疾病NAFLD，不仅是我国第一大慢性肝病和健康查体肝酶异常的主要原因，也是西方国家肝功能异常和慢性肝病最主要的原因[10]。NAFLD病因学的机制包括增加大量游离脂肪酸，降低游离脂肪酸的β-氧化，增加脂质过氧化等作用。饮食因素可影响NAFLD等各类肝脏疾病的脂肪渗透和脂质过氧化，而对于NAFLD的饮食治疗方法[11]强调严格控制热量摄入，控制饮食中脂质、蛋白质和碳水化合物的摄入量。研究发现，饱和脂肪酸的过量摄入可导致内质网损伤、肝脂肪变和炎症。不适当的膳食脂肪摄入、过量的软饮料摄入、胰岛素抵抗和氧化应激的增加导致游离脂肪酸向肝脏的输送增加和肝甘油三酯的积累增加。

NAFLD患者通常有饮食不规律的不良习惯，并且狂热追求高热、高脂、口味重的饮食，因而导致脂肪在体内过度积聚，加速NAFLD的形成及恶化。中碳链甘油三酯不易在肝脏中沉积，可减轻肝脏代谢的压力，并且中碳链甘油三酯是一种安全无毒物质，有显著减轻体重的作用，其代谢途径独特、供能快速。本实验采用NAFLD模型的建立、甘油三酯定量测定法、总胆固醇定量测定法以及苏木精-伊红染色法。探索是否通过摄入一定量的樟树籽仁油可以改善脂质在NAFLD小鼠肝脏内的聚集，改善肝功能，从而在不影响油脂摄入量和改善食品风味的前提下，探索出新型油脂，积极并且有效纠正机体的能量失衡。

1.实验材料

1.1 动物及饲料

健康 C57BL/6J小鼠 10只，雄性，体质量 12～25 g，动物许可证号：SYXK（鲁）2016 0008，饲养于济南朋悦实验动物繁育有限公司。MCD模型饲料（基于AIN93G标准，10%玉米油、高糖）南通特洛菲饲料有限公司加工制作。符合实验饲料卫生标准。基本组成：玉米、小麦、大豆油、十分、鱼粉、磷酸氢钙、维生素、矿物质等，营养成分保证值（%）：水分≤100，粗蛋白≥220，粗脂肪≥40，粗纤维≤50，粗灰分≤80，钙：10-18，磷：6-12，赖氨酸≥13.2，蛋氨酸±7.8 及胱氨酸≥7.8。济南朋悦实验动物繁育有限公司加工制作。

1.2 主要试剂与仪器

樟树籽仁油为南昌大学实验室提供，大豆油、猪油、无水乙醇、TG和TC试剂盒（南京建成生物工程研究所）、HBS-1096A酶标仪、电子天平、SPX-250生化培养箱、TD5A台式低速离心机。

2.实验方法

2.1技术路线

2.2建立非酒精性脂肪肝病模型组

小鼠适应性喂养1周后，再根据体重随机分为 2 组。即：对照组（n=2）、非酒精性脂肪肝病模型组（n=8）。对照组，全程喂食标准饲料。NAFLD模型组喂食MCD模型饲料，喂食6周后，通过肝脏HE染色、油红O染色和TG、TC含量检测等确定肝脂变模型的建立。构建成功的NAFLD模型小鼠根据随机数字法分为4组，即樟树籽仁油组、猪油组、大豆油组及自然恢复组，每组各 2 只，分别灌胃樟树籽仁油、猪油、大豆油，自然恢复组及对照组灌胃磷酸盐缓冲溶液，灌胃容量初期为100uL/只，小鼠适应灌胃过程一周后，灌胃剂量增加至200uL/只。實验周期为4w，期间小鼠自由摄食、饮水，需要定期观察并测定相应指标。

2.3内脏器官采集

实验结束小鼠眼球取血后，颈椎脱臼处死，再使用75%的酒精棉球对小鼠腹部皮肤消毒，用镊子将小鼠的腹部的皮肤挑起，随后用手术剪将腹腔和胸腔剪开，仔细观察小鼠各内脏器官，小心分离，用生理盐水洗净，用天平称重，最后放入-20℃冰箱待用。

2.4脏器指数

实验结束时，迅速分离腹部脂肪、肝脏，用滤纸将组织液吸干后，称重并计算脏器指数。计算公式：臟器指数（%）=脏器湿重/体重 × 100%。

2.5 肝脂检测

各组分别取肝脏右叶重约0.5 g，按重量（g）：体积（ml）= 1：9 的比例，加入匀浆介质中，冰水浴条件下匀浆，2500 r/min，离心10分钟，取部分上清液依次稀释，采用酶标仪分别检测肝脏原液，2倍稀释液，4倍稀释液，测定TG、TC含量。

2.5.1甘油三酯的测定

甘油三酯在脂肪酶、甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和过氧化酶的作用下生成的醌类化合物颜色的深浅与甘油三酯的含量成正比（GPO-PAP 法），分别测定标准管和样品管的吸光度值，可计算样品中甘油三酯的含量。

取96孔板按试剂盒操作表加样，充分混匀，于37℃生化培养箱中孵育 10 分钟，设定酶标仪波长为 492 nm，测定各管吸光度值。根据校准品的标准曲线计算样品中TG的含量。

2.5.2胆固醇的测定

胆固醇酯在胆固醇酯酶、氧化酶和过氧化酶的催化作用下生成红色醌化物。操作步骤同2.5.1，再根据校准品的标准曲线计算样品中TC的含量。

2.6组织细胞形态学

选取固定液为10%福尔马林溶液，取部分肝脏，称重并浸入配好的固定液中。固定好的肝脏经一系列操作后HE染色，用于组织病理学观察。

3.结果与讨论

3.1 动物一般情况

在实验期间，各组小鼠精神状态稳定，饮水摄食均正常，并未出现任何异常表现及死亡现象。NAFLD模型构建成功后，小鼠行动缓慢，活动量减少，体重减轻，与空白组相比，粪便不成型具有较明显的油腻感。

3.2 樟树籽仁油对NAFLD小鼠肝脏指数的影响

动物染毒后，受损脏器重量将会发生改变，因而脏器系数也相应而改变。根据表3.2脏器指数，对比空白组与樟树籽仁油，观察发现，两组实验数据相近，脏器与体重的比值比较恒定，樟树籽仁油组脏器受损程度较小，对比空白组发现，猪油组、大豆油组肝脏指数减小，表示肝脏出现萎缩及其他退行性改变，其中猪油组肝脏受损程度最大;自然恢复组肝脏指数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等。

3.3 樟树籽仁油对NAFLD小鼠肝脏中TG含量的影响

肝脏是内源性血脂和脂蛋白合成及代谢的重要场所，与脂代谢密切相关。通过脂代谢进入肝脏的脂肪被不断合成TG并以脂蛋白形式进入血循环，形成动态平衡。肝内合成及运转平衡一旦失衡则会导致TG在肝内堆积而形成非酒精性脂肪肝。由表3.3可知，樟树籽仁油组小鼠肝脏中TG浓度与正常对照组无显著性差异，而猪油、大豆油组及自然恢复组小鼠肝脏中TG浓度则显著高于对照组和樟树籽仁油组。

3.4 樟树籽仁油对NAFLD小鼠肝脏中TC含量的影响

由表3.4可知，樟树籽仁油组小鼠肝脏中TC浓度与正常对照组无显著性差异，而猪油、大豆油组及自然恢复组小鼠肝脏中TC浓度则显著高于正常对照组和樟树籽仁油组。

3.5 组织病理学分析

自然恢复组、大豆油组、猪油组小鼠肝细胞胞质内显现出大小不等、圆形、有张力的脂滴空泡，其中猪油组尤为严重，肝细胞脂变，肝脏组织受到不同程度的损伤。而樟树籽仁油组肝组织细胞结构类似于正常对照组，结构完整，无变性坏死。

结论：

本实验结果显示，小鼠经MCD饲料诱导后，NAFLD模型组小鼠行动缓慢，活动量减少，体重较轻，粪便具有明显的油腻感，且肝脏均呈淡黄色，表明高脂饲料对肝脏造成一定损伤，NAFLD造模成功。实验中樟树籽仁油组小鼠肝脏受损程度较小。与猪油、大豆油相比，樟树籽仁油能够显著降低NAFLD 小鼠肝脏中TG、TC浓度。组织病理学观察结果表明樟树籽仁油是一种无毒、健康的油脂，能够有效降低NAFLD小鼠肝脂水平，有利于肝功能的恢复，具有保护肝脏的作用，为该疾病的患者提供了一种膳食用油参考。

参考文献

[1]  肖复明，江香梅，熊彩云，等. 樟树种子油中脂肪酸成分分析[J]. 江西林业科技，2008（01）：60-61.

[2]  中国油脂植物编写委员会. 中国油脂植物[Z]. 北京：科学出版社，1987.

[3]  Zhao M L，Yang H，Yang F，et al. composition analysis of Cinnamomum camphor seedkernel oil and shell oil[J]. Journal of Nanchang University（Natural Science），2012，36（05）：445-448.

[4]  曾哲灵，王林林，郑菲，等. 樟树籽仁油合成癸/月桂酰基谷氨酸钠工艺研究[J]. 中国油脂，2013（02）：69-72.

[5]  陈绪军，曾哲灵，高文帅，等. 单癸酸甘油酯的制备及理化性质[J]. 南昌大学学报（理科版），2015（02）：168-174.

[6]  Bray G A，Lee M，Bray T L. Weight gain of rats fed medium-chain triglycerides is lessthan rats fed long-chain triglycerides.[J]. International journal of obesity，1979，4（1）：27-32.

[7]  王报贵. 中碳链脂肪酸改善脂变肝细胞损伤和脂代谢紊乱的机制[D].南昌大学，2017.

[8]  Hashim S A，Tantibhedyangkul P. Medium chain triglyceride in early life：effects on growth of adipose tissue[J]. Lipids，1987，22（6）：429-434.

[9]  Ooyama K，Kojima K，Aoyama T，et al. Decrease of food intake in rats after ingestion of medium-chain triacylglycerol.[J]. J Nutr Sci Vitaminol（Tokyo），2009，55（5）：423-427.

[10]  冯瑞兵 .胰岛素抵抗与非酒精性脂肪性肝病 [J].临床误诊误治，2013，26（11）：100-103.

[11]  常彬霞，邹正升，李保森，等. 2015 年日本胃肠病学会非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎循证医学治疗指南[J].临床肝胆病杂志 2015，31（7）：1027 -1030.

作者简介：罗松，男，滨州学院本科在校生，生物制药专业，主持山东省创新创业项目。

通讯联系人：王报贵，博士。

基金项目：滨州学院博士科研启动费（2018Y18）;山东省创新训练项目（S201910449037）。