两种肥力水平下冬小麦氮素吸收运转和代谢研究

李 艳，彭超军，王玉民，胡 琳，齐学礼

(河南省农业科学院小麦研究所/小麦国家工程实验室/河南省小麦生物学重点实验室，河南郑州 450002)

氮是植物生长发育所必需的第一大矿质营养元素。氮肥作为最重要的农业生产投入品之一，为农作物产量的大幅度提高做出了重要贡献。但氮肥的过度施用也造成了农业生态系统的破坏，如土壤酸化、地下水硝酸盐超标、温室气体排放等环境污染问题[1-5]，同时，亦降低了肥料利用效率，提高了生产成本[6-9]。小麦籽粒产量和蛋白质含量与氮肥的合理施用及氮代谢密切相关，合理运筹氮肥是实现小麦优质高产高效的重要措施[10-11]。

小麦籽粒中的氮素有相当一部分来自于营养器官氮素的花后再转移[10]，营养器官转移至穗中的氮素占穗氮累积量的51%～91%[12]。小麦开花前后的氮同化能力存在基因型差异，高产高蛋白小麦品种植株不仅开花前后氮同化量及干物质累积量高，而且花后具有氮转运效率高的特性[13]。籽粒蛋白质含量与氮素转移效率和氮素收获指数呈显著正相关[14]。小麦植株体内的氮素主要是以氨基酸的形式运输到籽粒，用于合成籽粒蛋白质；且游离氨基酸含量与籽粒蛋白质合成相关指标呈显著或极显著正相关[15]。增施氮肥能提高小麦氮代谢同化途径关键酶活性[10]和地上部总游离氨基酸含量。研究表明，小麦籽粒氨基酸含量存在基因型间差异[16]。目前，针对不同品质类型的小麦在氮素同化利用和氮代谢方面的系统研究报道比较少，尤其是关于氮同化途径关键酶基因表达的研究。本研究拟以强筋小麦品种郑麦7698和中筋小麦品种周麦18为材料，分析高肥和低肥水平下，小麦植株的氮素吸收转运、游离氨基酸含量、氮同化途径关键酶基因的表达及产量性状，旨在为选育高产优质高效的小麦新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

研究于2016-2017年在河南现代农业研究开发基地进行。供试品种为生产中大面积推广品种郑麦7698和河南省区试对照品种周麦18。

试验设高肥和低肥两个肥力水平，高肥基础肥力：有机质10.6 g·kg-1，碱解氮73.9 mg·kg-1，有效磷40.2 mg·kg-1，速效钾189.5 mg·kg-1。高肥处理施肥：有机肥7 500 kg·hm-2，尿素375 kg·hm-2，磷酸二铵300 kg·hm-2，氯化钾75 kg·hm-2。低肥基础肥力：有机质9.3 mg·kg-1，碱解氮62.0 mg·kg-1，有效磷9.5 mg·kg-1，速效钾76.5 mg·kg-1。低肥处理施肥：尿素187.5 kg·hm-2，磷酸二铵150 kg·hm-2，氯化钾 37.5 kg·hm-2。4个重复，小区面积为6.75 m2，播量为每小区100 g，于2016年10月7日播种。

1.2 测定指标和方法

1.2.1 氮素含量的测定

于小麦开花期取样，剪去植株的根系，将地上部分为叶、茎鞘、穗三部分；105 ℃杀青0.5 h， 70 ℃烘干至恒重，称重后粉碎。地上部干物质重为叶、茎鞘、穗干物质重之和。利用碳氮元素分析仪(Vario Micro Cube, CHNS model, Elementar, Hanua, Germany)测定样品中氮浓度。每个组织器官的干物质重乘氮浓度可得氮素量。

氮素收获指数=成熟期籽粒氮积累量/成熟期地上部总氮积累量；氮素转运量=开花期植株氮素积累积累量-成熟期营养器官氮素积累总量；花后氮同化量=籽粒氮素积累总量-氮素转运量。

1.2.2 氨基酸含量的测定

于拔节期、开花期和成熟期取小麦植株旗叶，保存在液氮中。称取小麦旗叶1 g，在研钵中加入液氮，将叶片研磨成细粉，迅速转移至10 mL离心管中，加入100 mM HCl 3 mL，涡旋混合1 min后超声提取30 min，加入6%(w/v)磺基水杨酸溶液1 mL，沉淀蛋白，充分振摇后，于4 ℃下 10 000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，滤液用氨基酸分析仪测定(L8 900, Hitachi, Japan)。标准品试剂购自Wako Pure Chemical Industries(Japan)，不同pH洗脱液购自Mitsubishi Chemical Industry(Japan)。外标法测定样品溶液中各游离氨基酸含量，其中脯氨酸在 440 nm波长下检测，其他氨基酸在 570 nm波长下检测 。

1.2.3 基因相对表达量的测定

于开花期取小麦植株旗叶，保存在液氮中。样品RNA提取采用Ultrapure RNA kit试剂盒(康为世纪生物科技有限公司，北京)，按照说明进行操作，利用1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。采用ReverTre Ace qPCR RT Kit(TOYOBO,Japan)试剂盒，按照说明进行反转录合成cDNA。利用分光光度计(NanoDrop 2000,Thermo Scientific,USA)检测提取的RNA和cDNA浓度。氮代谢相关酶基因的引物依据NCBI数据库中登录号所对应的序列，利用Primer premier 5.0软件设计，目的基因和内参基因(Actin)的引物见表1。qRT-PCR在Bio-Rad iQTM5定量PCR仪上进行，SYBR Green 购自Thermo scientific,USA。反应体系为25 μL。反应程序： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，40个循环。每个样品重复3次。基因相对表达量参照2-△△Ct法计算[17]。

表1 氮代谢同化酶基因的qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers for nitrogen metabolism related genes

1.2.4 产量性状调查

小麦成熟后，进行实打测产，并调查穗数、穗粒数、千粒重。

1.3 数据处理

所有数据均为3次重复的平均值。运用SPSS 20.0对所有数据进行单因素方差分析，用Fisher’s最小差异显著法(LSD)进行t检验。用Excel 2010制作图表。

2 结果与分析

2.1 两种肥力水平下小麦的氮素吸收运转特性

2.1.1 植株地上部氮素积累量及其收获指数

从表2可以看出，郑麦7698和周麦18的氮素累积量随生育期后移而增加，成熟期积累量最高；同一生育时期，肥力水平越高，地上部氮素积累量越多。各生育时期，高肥和低肥水平下郑麦7698植株的地上部氮素积累量均显著或不显著高于周麦18。

高肥水平下，郑麦7698的氮素收获指数略低于周麦18，而低肥水平下显著高于周麦18。说明低肥水平下郑麦7698的氮素利用效率显著高于周麦18。

2.1.2 氮素转运量和花后氮同化量

由表3可以看出，在高肥和低肥水平下，郑麦7698氮素转运量和花后氮同化量均显著高于周麦18。两个品种在高肥水平下的氮素转运量和花后氮同化量均显著高于低肥水平(P<0.05)，说明增加施肥量可以提高小麦氮素转运量和花后氮同化量。

由表3还可看出，氮素转运量占籽粒氮积累总量的71.97%～84.47%，花后氮同化量占籽粒氮积累总量的15.53%～28.03%，说明籽粒中的氮主要来源于花前营养器官的再运转，提高花前营养器官的氮素含量有利于促进籽粒氮的积累。郑麦7698在两种肥力水平的氮素转运量占籽粒氮的比例均显著低于周麦18，花后氮同化量占籽粒氮比例则均显著高于周麦18。两个品种高肥下的氮素转运量占籽粒氮比例显著低于低肥，花后氮同化量占籽粒氮比例则显著高于低肥(P<0.05)。

表2 两种肥力条件下植株地上部氮素含量和氮素收获指数Table 2 Nitrogen content of shoot and nitrogen harvest index(NHI) under two fertility treatments

*代表郑麦7698与周麦18的差异显著(P<0.05)。下同。

* indicate significant differences between Zhengmai 7698 and Zhoumai 18(P<0.05).The same below.

表3 两种肥力条件下小麦氮素同化运转特性Table 3 Characteristics of nitrogen assimilation and translocation in wheat under two fertility treatments

2.1.3 关键氨基酸含量

由表4可以看出，高肥和低肥水平下，郑麦7698的总游离氨基酸含量分别比周麦18提高了1.33%和11.35%，郑麦7698中天冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺的平均含量均显著高于周麦18，而丝氨酸的平均含量显著低于周麦18；其余氨基酸的平均含量，在低肥水平下除了异亮氨酸和脯氨酸的平均含量，郑麦7698显著低于周麦18之外，郑麦7698与周麦18的其他氨基酸平均含量差异不显著。在两种肥力水平下，郑麦7698的谷氨酰胺占总游离氨基酸的比例均显著高于周麦18；郑麦7698的总游离氨基酸含量均高于周麦18；高肥水平两个品种开花期小麦旗叶总游离氨基酸及多数氨基酸含量均高于低肥水平。说明增加施肥量可以提高小麦植株旗叶总游离氨基酸及多数氨基酸含量。

2.2 两种肥力水平下氮代谢相关酶基因的表达

植物叶片涉及氮代谢的主要同化酶基因有硝酸还原酶基因NR、谷氨酰胺合成酶基因GS、谷氨酸合酶基因GOGAT、谷氨酸脱氢酶基因GDH、天冬氨酸氨基转移酶基因AspAT、天冬酰胺合成酶基因ASN。由图1可以看出，低肥水平下，开花期郑麦7698旗叶中TaGS2、TaGOGAT、TaGDH、TaAspAT、TaASN1基因的相对表达量均极显著高于周麦18。高肥水平下，郑麦7698旗叶中TaNR、TaGS2、TaGOGAT、TaGDH基因的相对表达量显著或极显著高于周麦18，而郑麦7698与周麦18的TaNR、TaAspAT和TaASN1基因相对表达量差异不显著。说明低肥水平下，郑麦7698氮代谢主要同化途径酶基因的相对表达量极显著高于周麦18，使郑麦7698比周麦18具有更强的氮素吸收能力。

表4 两种肥力条件下小麦叶片各游离氨基酸含量Table 4 Free amino acid content in flag leaves of wheat under two fertility treatments nmol·g-1 FW

占比指占总氨基酸含量的百分比。

Ratio means the percentage of individual amino acid in total amino acids.

2.3 两种肥力水平下小麦的籽粒产量及其构成因素

由表5可知，郑麦7698在高肥水平的产量比低肥水平增产21.0%，周麦18增产23.9%，说明高肥水平有利于小麦籽粒产量增加；低肥水平下郑麦7698产量下降幅度较周麦18小。高肥和低肥水平下，郑麦7698比周麦18分别增产0.64%和3.06%。两种肥力下郑麦7698的穗粒数均显著高于周麦18，有效穗数和千粒重在品种间无显著差异。说明郑麦7698比周麦18具有较高的产量水平，且郑麦7698对肥力的敏感性较弱。

3 讨 论

3.1 土壤肥力和基因型对小麦植株氮素吸收转运的影响

小麦形成籽粒产量所需氮素约有80%来自开花前营养器官积累的氮素向籽粒的再转运，20%来自开花后氮素的吸收同化[18-20]。合理运筹氮肥可以促进小麦植株花前营养器官氮素的积累，有利于氮素向籽粒转运，从而提高小麦籽粒产量和氮素利用效率[21-22]。

H：高肥处理；L：低肥处理，*和**分别代表郑麦7698与周麦18的差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。

H:High fertility treatment; L:Low fertility treatment.* and ** indicate significant differences between Zhengmai 7698 and Zhoumai 18 at 0.05 and 0.01 levels，respectively.

图1 两种肥力条件下小麦植株叶片氮代谢途径关键酶基因的相对表达水平

施氮可以增加小麦植株的氮素吸收和花前营养器官的氮累积[23-24]，但降低了花后营养器官积累的氮素向籽粒的转运效率[11]。本研究结果表明，同一品种在高肥水平下的氮素转运量和花后氮同化量均明显高于低肥水平。说明增加施氮量可增加小麦地上部氮素积累总量和转运量。同一肥力水平下，强筋小麦品种郑麦7698的氮素转运量和花后氮同化量均显著高于中筋小麦品种周麦18，说明氮素吸收利用效率在小麦基因型间存在显著差异，这与前人研究结果一致[25]。开花期之前，郑麦7698地上部氮素积累总量比周麦18提高幅度在高肥水平下大于低肥水平，而在成熟期低肥水平大于高肥水平，说明郑麦7698花前和花后吸氮量均大于周麦18，低肥水平下花后吸氮量郑麦7698表现更强。进一步证明强筋小麦郑麦7698比中筋小麦周麦18具有较强的氮素吸收效率。因此，在小麦生产中，应选择花前氮素积累量高，花后氮转运量和吸收量强的小麦品种，不仅可提高小麦的籽粒产量，也可改善其品质特性。

3.2 土壤肥力对小麦氮代谢的影响

增施氮肥促使植株体内多个途径中的多个基因发生响应，除了植株体内氮的再循环和再活化途径之外，氮的吸收、同化和转运过程，根据基因型、环境和施氮水平不同，对氮肥的响应亦存在差异[26]。小麦氮代谢同化途径关键酶包括硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、谷氨酸脱氢酶、天冬氨酸氨基转移酶和天冬酰胺合成酶。谷氨酰胺是非必要氨基酸，但在代谢中起非常重要的作用，是构成蛋白质的氨基酸，又是合成含氮物质的氮源。氨基酸是小麦籽粒蛋白的组成成份，其总含量可以近似的代表蛋白质含量[27]。增施氮肥可显著提高根系的谷氨酰胺合成酶活性[11]和各器官中的游离氨基酸含量。本研究结果表明，高肥水平下小麦谷氨酰胺在叶片中的含量及其占总游离氨基酸的比例显著高于低肥。在两种肥力水平下，郑麦7698谷氨酰胺含量及其占总游离氨基酸比例均显著高于周麦18。氮代谢同化途径关键酶基因的相对表达量随肥力水平降低而提高，低肥水平下，郑麦7698氮代谢关键酶基因相对表达量均极显著高于周麦18，这导致了郑麦7698具有较强氮素吸收能力和较高的氨基酸含量。另外，郑麦7698的产量在低肥水平下明显高于周麦18，且随着施肥量减少，郑麦7698产量下降幅度较小。说明增强氮代谢途径关键酶基因的表达，可以促进小麦植株对氮素的吸收同化能力，提高游离氨基酸含量，进而提升小麦产量水平。综上所述，低肥水平下，郑麦7698较周麦18具有较高的氮素吸收能力，花后具有较高的氮素转运率和花后氮同化量，其氮代谢关键酶活性基因的表达量也显著高于周麦18，这是其在具有强筋特性的同时仍能保持高产的原因，也是郑麦7698具有高产、优质、高效特性的机制。