正交试验法优选清炎凝胶的提取工艺

陈海红 甘灿云 杨海燕

浙江省杭州市中医院 浙江 杭州 310007

清炎洗剂[1]是我院中医妇科特色医院制剂，全方由蛇床子、苦参、苦楝皮等6味中药组成，经煎煮、浓缩制成供妇科熏洗的洗剂，具有显著的清热燥湿、止痒杀虫功效，用于外阴炎，疗效确切。按照临床的要求，笔者将本处方开发成凝胶剂，以方便使用。处方所含主要药效活性成分为香豆素类、生物碱类、黄酮类、鞣质、皂苷等。针对复方制剂成分复杂，且常常是多成分、多靶点综合发挥作用的现实情况，笔者选用乙醇作为提取溶剂，并以君药蛇床子中的蛇床子素、苦参碱提取量和出膏量为考察指标，对清炎凝胶的提取工艺进行考察，通过正交试验法优选方中药材提取工艺，以为该制剂的实际生产提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器：LC-20岛津高效液相色谱仪系列，DHG9246A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），RE-200B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ-400DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），XS105DR电子分析天平（梅特勒-托利多），BS224电子天平(赛多利斯)，DK-S24电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）

1.2 药材、药品与试剂：蛇床子、苦参、苦楝皮、白鲜皮、南鹤虱、重楼（浙江中医药大学中药饮片有限公司）；蛇床子素对照品(110822-200406)，苦参碱对照品(110805-200508)，以上对照品均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；试验用水为重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验优选提取工艺：分述如下。

2.1.1 因素水平：在分析处方中各药味所含主要成分的基础上，用乙醇回流提取。考虑到此法与传统的水煎醇沉方法的利弊比较，为了极大地保存活性成分，拟采用含水乙醇回流提取的工艺路线，并选择蛇床子指标成分蛇床子素提取量、苦参指标成分苦参碱提取量以及出膏率作为评价指标，采用L9(34)正交表进行试验设计，以乙醇体积分数（A）、加醇量（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为影响因素进行优化。因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.1.2 试验方法[2]：按照处方比例称取蛇床子（12g）、苦参（12g）等中药饮片，置于提取回流装置中，以不同体积分数乙醇为提取溶剂，按正交试验条件进行提取，提取液合并滤过，滤液回收乙醇浓缩后定容至100ml，共制得9份提取液，备用。

2.1.3 出膏率的测定[3]：精密吸取上述提取液各20ml，分别置于已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3h；移至干燥器中，冷却30min，迅速精密称定质量，计算出膏率：出膏率＝[干膏质量（g）/药材总质量（g）]×100%。

2.1.4 蛇床子素提取量测定：分述如下。

2.1.4.1 色谱条件[4-5]：色谱柱Agilent C18(150mm×4.6mm,5μm)，以乙腈-水(65∶35)为流动相，流速为1.0ml/min，柱温为25℃，检测波长为322nm；进样量：20μl。理论塔板数按蛇床子素计不低于3000，在此条件下蛇床子素与其它组分达到基线分离。

2.1.4.2 蛇床子素对照品贮备液的制备：精密称取蛇床子素对照品10.10mg置25ml的容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得蛇床子素对照品贮备液。

2.1.4.3 供试品溶液的制备：取正交试验的浸膏样各0.1g，精密称定，加无水乙醇适量，超声处理30min，定容至10ml，再精密量取2m1置10ml容量瓶中并加无水乙醇至刻度，摇匀、滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液20μl，供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，依法测定，即得。

2.1.4.4 线性关系考察：分别精密吸取蛇床子素对照品贮备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，置10ml容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀得 20.2、40.4、60.6、80.8、101.0μg/ml的蛇床子素系列对照品溶液，按上述色谱条件测定，分别精密吸取20μl注入液相色谱仪，以对照品浓度（μg/ml）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，得回归方程Y=77227X+62901(r=0.9999)，蛇床子素在20.2～101.0μg/ml范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

2.1.4.5 精密度试验：吸取蛇床子素对照品贮备液20μl，连续进样6次测定。结果蛇床子素峰面积的RSD为0.053%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.4.6 稳定性试验：吸取同一供试品溶液20μl于1、2、3、4、5、6h进样测定。结果蛇床子素峰面积的RSD为0.32%（n=6），表明供试品溶液在6h内基本稳定。

2.1.4.7 重复性试验：取同一批样品6份，同法制备供试品溶液，进样测定。结果蛇床子素峰面积的RSD为1.95%（n=6）。

2.1.5 苦参碱提取量测定：分述如下。

2.1.5.1 色谱条件[4]：色谱柱：Agilent ZOBAX NH2(150mm×4.6mm,5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液(80∶10∶10)；流速：1m1/min；检测波长：265nm；进样量：20μl。理论塔板数按苦参碱计不低于2000。在此色谱条件下，供试品色谱中，在与对照品色谱相同的保留时间处有一色谱峰，并与其它组分能达到基线分离。

2.1.5.2 苦参碱对照品贮备液的制备：精密称取苦参碱对照品约10.38mg，置25ml容量瓶中，加乙腈∶无水乙醇（80∶20）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含苦参碱0.4152mg）。

2.1.5.3 供试品溶液的制备：取正交试验的浸膏样0.1g，精密称定，加无水乙醇适量，经过超声处理30min，并用无水乙醇定容至10ml。再精密量取1ml置10ml容量瓶中并加无水乙醇稀释至刻度，摇匀并滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液20μl，供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，依法测定，即得。

2.1.5.4 线性关系考察：分别精密吸取苦参碱对照品贮备液(0.4152mg/ml)0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ml，置10ml容量瓶中，加乙腈∶无水乙醇（80∶20）稀释至刻度，摇匀得 8.304、16.608、33.216、66.432、132.864μg/ml的苦参碱系列对照品溶液，按上述色谱条件测定，分别精密吸取20μl注入液相色谱仪进样测定，以峰面积积分值为纵坐标，进样浓度(μg/ml)为横坐标，得回归方程Y=13855X+39491（r=0.9997），苦 参 碱 在 8.304～132.864μg/ml范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

2.1.5.5 精密度试验：吸取苦参碱对照品贮备液20μl，连续进样6次测定。结果蛇床子素峰面积的RSD为0.23%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.5.6 稳定性试验：吸取同一供试品溶液20μl于1、2、3、4、5、6h进样测定。结果苦参碱峰面积的RSD为1.32%（n=6），表明供试品溶液在6h内基本稳定。

2.1.5.7 重复性试验：取同一批样品6份，同法制备供试品溶液，进样测定。结果苦参碱峰面积的RSD为2.15%（n=6）。

表2 L9(34)正交试验结果表

2.1.6 正交试验及方差分析：按照正交试验设计表进行回流提取，共得到9份提取液，按“2.1.3”“2.1.4”“2.1.5”项下方法测定蛇床子和苦参碱提取量以及出膏量，采用综合评分法[6]，依据以上3个指标的重要性，以确定苦参碱提取量权重0.4，蛇床子素提取量权重0.4，出膏率权重0.2；分别以蛇床子素提取量、苦参碱提取量及出膏量中最高测量值为满分100，其他均通过与最高得分进行换算。每项评分得分=单项测量值/单项最高值×权重分值，结果见表2，方差分析见表3。

表3 方差分析表

由表可知，各因素对提取影响大小的顺序为提取次数＞提取时间＞溶剂体积分数＞溶剂量；提取次数对提取结果有显著性的差异。综合考虑实际生产中的成本和时间等因素，最终确定最佳工艺为A2B1C3D3，即加6倍量70%乙醇回流3次,每次2h。

2.2 提取工艺验证：按处方比例称取蛇床子、苦参、苦楝皮、白鲜皮等中药饮片，按上述最佳工艺提取药材,即加浓度为70%乙醇6倍量，加热回流提取3次，每次2小时。平行提取3份，并按“2.1.3”“2.1.4”“2.1.5”项下方法测定蛇床素、苦参碱提取量及出膏量，结果见表4。

表4 验证试验结果(n=3)

由验证试验结果可知，最佳工艺中，蛇床子素平均提取量为75.81mg/g，RSD为2.63%；苦参碱平均提取量为83.94mg/g，RSD为2.35%；平均出膏率为15.14%，RSD为2.26%（RSD＜3.00%，n＝3），表明此提取工艺稳定可行。

3 讨论

中药成方制剂中药物组成成分复杂，其药效的物质基础是复方所含的全成分，而单一考察指标所筛选出的中药成方制剂提取工艺条件往往不够全面，不能完全代表中药成方制剂整体质量的优劣，故应选择多个药效成分或指标成分，同时出膏率也是一个重要指标，它代表了其他未知或不便检测的成分。本试验以蛇床子素提取量、苦参碱提取量、出膏率为指标，考察清炎凝胶的回流提取工艺，具有更好的针对性。

清炎凝胶处方以蛇床子、苦参为主药，苦参具有清热燥湿、祛风杀虫、利尿的作用，蛇床子温肾壮阳，外用燥湿杀虫，与其余4味药合用，共奏清热燥湿、止痒杀虫之功。本处方中药材所含有效成分主要为生物碱、香豆素、挥发油、皂苷等，本试验采用含水乙醇回流的方法，最大限度地提取相应的有效成分。笔者通过L9(34)正交试验研究，确定清炎凝胶最佳提取工艺为：选用6倍量70%乙醇提取3次，每次2小时。且验证试验表明该提取工艺稳定可行，为以后大批量生产提供了基础。