基于卵巢Kisspeptin/GPR54系统的补肾助孕方干预黄体功能不全大鼠生殖功能的机制研究*

石明晴 周惠芳 徐晓飞 江伟华#

1 浙江省丽水市中医院 浙江 丽水 323000

2 南京中医药大学附属医院 江苏 南京 210029

黄体功能不全（LPD）是引起不孕症的内分泌因素之一，大量研究显示有5%～10%的不孕症由LPD引起[1]。Kisspeptin是调控女性生殖内分泌功能的一种多肽类激素，可通过介导雌二醇的正负反馈作用而调节促性腺激素释放激素（GnRH）的分泌，继而参与调节生殖系统的生长发育、生殖激素的分泌，以及维持下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴的稳定[2]。本文拟研究夏桂成教授经验方补肾助孕方是否通过影响卵巢的Kisspeptin/GPR54系统，从而促进成熟卵泡排卵和健全黄体，以观察补肾助孕方对Kisspeptin/GPR54系统的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：8周龄雌性SD大鼠（体重200～220g）购自南京中医药大学实验动物中心（许可证号：SYXK-2013-0025）。SPF环境饲养。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 药物制备方法：研磨地屈孕酮片（荷兰Abbott Biologicals B.V.，10mg/片，批号：H20170221）和米非司酮片（浙江仙琚制药股份有限公司，25mg/片，批号：H20000649），分别配置成浓度0.4、1.0mg/ml的药液。补肾助孕方含怀山药、菟丝子各15g，炒白芍、鹿角片、山萸肉各10g，醋柴胡6g等8味中药，中药饮片由南京中医药大学百草堂提供，采用水提法将补肾助孕方制成2g/ml的药液。

1.2.2 动物分组、造模及给药：6周龄雌性SD大鼠40只，随机分为对照组（A）、LPD模型组（B）、补肾助孕方组（C）、地屈孕酮阳性对照组（D）。以上3种药物均按“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”换算。动物模型的制备按照相关文献描述的内容进行处理[3]。每天8：00进行阴道涂片，发现典型动情期表现的时间（排卵后黄体早期）即记为D1，除对照组外，其余3组大鼠分别在D1和D5灌胃米非司酮混悬液，并从第3个性周期（D9）开始，分别于D9、D13 16：00以及D10、D14 8：00，给予生理盐水、地屈孕酮药液和补肾助孕方溶液分别灌胃模型组、地屈孕酮组及补肾助孕方组，对照组在以上的各个给药时间点分别给予灌胃生理盐水。每组大鼠给药浓度均为100g体质量给予1ml药液。

1.2.3 样本收集：各组大鼠于D18 14：00，采用10%的水合氯醛和规格为2ml∶0.1g的氯胺酮注射液混匀（浓度为100g/0.2ml）进行腹腔注射麻醉，成功麻醉后，用剪刀打开大鼠的盆腔和腹腔，经腹主动脉进行动脉血的采集；然后断头处死大鼠，分离子宫、卵巢周围软组织后将子宫和双侧附件取出并在显微镜下观察形态。取部分组织置于-80℃冰箱冻存，并将剩余组织用于切片。将上述获得的动脉血采用1500g速度离心10min后，取上清获得血清样本。样本置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.4 Elisa法检测血清孕酮（P）、卵泡刺激素（FSH）及促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）含量：按照ELISA试剂盒（中国，北京中杉金桥有限公司，96T）说明书操作，记录在酶标仪450nm和570nm波长处的各处光密度（OD值）。绘制标准品标准曲线，计算样品中E2、P、LH及FSH含量。

1.2.5 Western Blot测定卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表达水平：将处于冷冻状态的卵巢组织加入（武汉Boster公司）裂解液∶PMSF=100∶1，进行裂解，转移至1.5ml离心管中，进行离心，离心条件：转速为12000rpm，温度为2～8℃，时间为10min。按BCA蛋白浓度试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）说明书进行检测蛋白含量，总蛋白样本加入2×Electrophoresis buffer(美国Bio Rad公司)100℃变性5min，后于-80℃保存。总蛋白采用8%～12%SDS-PAGE凝胶及垂直电泳槽进行电泳分离，PVDF膜半干膜法转膜，洗膜、封固、孵育一抗（按相应抗体说明书推荐浓度采用5%BSA配置）、二抗，Chemi DOCTMMP(美国Biorad公司)蛋白印迹-多功能成像系统进行图像数据采集及分析。

1.3 统计学方法：采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。研究数据均采用均数±标准差表示。计量资料比较选用独立样本t检验，以P＜0.05定义差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPD大鼠血清生殖激素水平比较：经补肾助孕方及地屈孕酮片干预后，大鼠的血清E2及FSH水平较模型组降低，而P、LH的水平较模型组升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；但补肾助孕方组与地屈孕酮片组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。如表1。

表1 生殖激素水平比较（-x±s，n=10）

2.2 LPD大鼠卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表达比较：经补肾助孕方及地屈孕酮片干预后，大鼠卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表达较模型组上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；但补肾助孕方组与地屈孕酮片组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。如表2。

表2 卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表达比较（-x±s）

3 讨论

LPD属于中医学“不孕”“月经失调”“胎漏”“胎动不安”等疾病范围。许淑怡等[4]认为黄体功能不全主要由于肝肾亏虚、天癸不足所致，采用调肝助癸法治疗黄体功能不全性不孕症，疗效显著。国医大师夏桂成教授根据长期临床经验，总结LPD的病因病机主要是肾虚偏阳夹有肝郁，并独创补肾助孕方以补肾助阳、佐以疏肝，用于经前期。方中以益肾助阳的鹿角片为君药，菟丝子平调肾中阴阳，并与具有滋阴补肾的怀山药、山萸肉、炒白芍等共同组成臣药，佐以醋柴胡以疏肝解郁和鼓舞阳气，诸药用于经前期，可以使“阳长至重”，使心肝气机得以调畅、心肝魂魄得以安定，便于更好地调控心（脑）-肾-子宫生殖轴，以利于调经和助孕。

Kisspeptin是由KiSS-1基因编码的一种多肽类激素，表达于卵巢，直接调控卵巢功能。研究发现，Kisspeptin和Kiss1r均表达于啮齿类、人类卵巢中，尤其强表达于成熟黄体的膜黄体和颗粒黄体细胞[5]。本研究发现，LPD模型大鼠卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表达降低；与模型组比较，补肾助孕方组大鼠卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表达均有所上升，并且发现补肾助孕方组大鼠卵巢血清P较模型组大鼠升高，因此推测补肾助孕方可能通过上调Kisspeptin和GPR54在黄体功能不全大鼠卵巢中的表达来提高卵巢分泌P的水平，从而改善黄体功能，最终改善LPD生殖功能。

本研究结果显示，LPD模型组大鼠血清LH水平较对照组显著升高，与上述结论大体一致。予补肾助孕方和地曲孕酮片干预后，治疗组和阳性对照组血清FSH水平较模型组降低，而LH的水平较模型组升高，说明补肾助孕方可以改善FSH、LH分泌水平。本研究显示血清FSH、LH的水平得到纠正，提示可能是由于补肾助孕方上调卵巢中Kisspeptin、GPR54的表达，调整了卵巢分泌P负向介导HPO轴功能，从而调节FSH或LH正常分泌，并促进子宫间质的蜕膜样改变和子宫内膜从生长转变阶段进入分泌阶段，从而为胚胎植入和进一步发展做好准备，并且纠正因黄体酮分泌不足导致子宫内膜发育不全的状态。而对补肾助孕方组与地屈孕酮片组大鼠卵巢Kisspeptin、GPR54蛋白表达及P、E2、FSH、LH水平进行比较，差异无统计学意义，说明补肾助孕方具有与地屈孕酮片相同的改善LPD生殖功能的作用。

综上所述，补肾助孕方可能通过Kisspeptin/GPR54系统调节P、E2、FSH和LH分泌水平，以及卵巢中Kisspeptin、GPR54表达水平等方面改善LPD的黄体功能，促进胚胎着床。