桩蛋白基因克隆及其在肝癌细胞Hep G2中的作用

孙达权?石静?石松?薛殿婷?徐莹莹

【摘要】目的 克隆桩蛋白基因（PXN）的蛋白编码区并构建PXN基因真核表达载体，建立PXN稳转肝癌细胞株，分析PXN基因对肝癌细胞的作用。方法 Trizol法提取肝癌细胞总RNA并逆转录成cDNA，PCR法扩增PXN基因蛋白编码区并构建真核表达质粒pEBFP-PXN。脂质体法转染肝癌细胞Hep G2，G418筛选培养获得桩蛋白高表达稳转肝癌细胞株。实时无标记细胞分析检测细胞生长速率，细胞创伤-愈合实验分析细胞迁移速率。蛋白免疫印迹法检测细胞内蛋白表达变化。结果 成功克隆PXN基因并构建真核表达载体pEBFP-PXN。获得桩蛋白高表达单克隆稳转肝癌细胞株，胞内显示蓝色荧光，蛋白免疫印迹法显示稳转株内表达外源融合蛋白BFP-PXN。桩蛋白表达不影响Hep G2肝癌细胞的生长速率但可以抑制其细胞迁移，稳转细胞上皮标志蛋白E-Cadherin表达升高、间质标志物N-Cadherin和Vimentin表达下降。结论 PXN基因不影响Hep G2肝癌细胞生长增殖速率但可以抑制其细胞迁移，这可能与其可以影响肝癌细胞上皮-间质转化标志蛋白表达有关。

【关键词】肝癌细胞;桩蛋白基因;真核表达;细胞迁移

桩蛋白基因（PXN）位于染色体12q24，有11个外显子，可编码559个氨基酸，其蛋白N端有5个亮氨酸-天冬氨酸酸性结合域（LD），可与黏着斑激酶（FAK）和纽蛋白结合，LD1到LD5结构相似但功能各异;桩蛋白N端还有几个脯氨酸富集SH3结合域;C端有4个串联的LIM结构域，每个LIM由2个锌指结构以疏水作用力结合，其中第3个LIM是桩蛋白与黏着斑蛋白重要结合区[1-2]。LIM不仅可以介导桩蛋白定位于黏着斑和细胞骨架的肌动蛋白上，还与多种蛋白如微管蛋白、雄激素和糖皮质激素的结合有关。桩蛋白上有许多酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点，参与细胞信号转导如FAK/Src、ERK等信号通路。研究发现，桩蛋白异常表达和异常磷酸化均与细胞生长、细胞黏附和迁移、形态转变等密切相关[2]。本研究欲通过克隆PXN基因并使其在肝癌细胞Hep G2中高表达，分析其对肝癌细胞Hep G2生长和迁移的影响。

材料与方法

一、主要材料和试剂

Trizol 和lipofectamine 2000试剂购自Invitrogen公司（美国），肝癌细胞株Hep G2购自中科院上海细胞库，RPMI-1640细胞培养基购自Gibco公司（美国），限制性核酸内切酶、高保真反转录试剂盒购自Takara公司（中国大连），新生牛血清购自杭州四季青生物有限公司，去内毒素质粒小提中量试剂盒购自北京天根生物有限公司，抗体购自北京博迈德生物有限公司，实时无标记细胞分析（RTCA）板购自艾森生物公司（美国），pEBFP-C1保存于本实验室。

二、方 法

1.细胞培养

用含10%新生牛血清的RPMI-1640细胞培养液在37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养Hep G2细胞。细胞长至80% ～ 90%用0.25%胰酶进行消化传代。

2. mRNA抽提及PCR反应

将Hep G2铺板于6 cm培养皿中，等细胞融合至80%时用PBS清洗3次，加入1 ml Trizol，充分吹打裂解细胞，移入1.5 ml离心管中，加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡30 s，室温静置10 min，4℃

12 000 转/分离心10 min，取上清液移入新的1.5 ml离心管中，加入0.5 ml异丙醇，颠倒混匀后4℃ 7 500 转/分离心10 min，弃去上清，加入1 ml预先配置好的75%的乙醇清洗，4℃ 7 500 转/分离心10 min，弃去上清，室温控干，加入RNase-free的双蒸水100 μl，RNA完整性检测并定量为1 μg/μl，

-80℃冻存备用。

取4 μg总RNA，然后用逆转录试剂盒按20 μl反应体系在42℃逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，用PXN基因（NM_002859）引物（5-TGCTCGAGCCATGGACGACCTCGACGCCCTGCT-3，5-CAGAATTCCTAGCAGAAGAGCTTGAGGAAGCAG-3）扩增获得桩蛋白编码区。

3. 真核表达载体构建

用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ对PXN PCR产物和真核表达载体pEBFP-C1进行双酶切，电泳回收并纯化后用T4 DNA ligase 4℃連接过夜，经细菌转化、卡那霉素筛选培养、单克隆挑取与扩大培养、质粒抽提、Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定后进行DNA测序鉴定，获得连接正确且未发生突变的重组质粒pEBFP-PXN。

4.细胞转染与药物筛选

转染前1 d将SMMC-7721细胞按50%量铺于6孔板中，用lipofectamine 2000将无内毒素的重组质粒pEBFP-PXN稳定性转染导入肝癌细胞中，转染3 d后在荧光显微镜下观察细胞荧光，并用0.5%的胰酶消化后转入10 cm细胞培养皿中，培养3 d后加入600 μg/ml的G418进行筛选培养，培养7 d后将G418浓度降低为维持浓度200 μg/ml，继续培养直至单克隆细胞集落形成。荧光显微镜下挑取蓝色荧光的细胞集落进行扩大培养。

5. 蛋白免疫印迹法

取1.2×106个细胞进行裂解，蛋白定量后加入SDS-PAGE上样缓冲液，震荡混匀后放入金属浴中100℃煮沸5 min，瞬时离心后震荡混匀，样品进行变性电泳、蛋白转膜和膜封闭后，加入一抗4℃孵育过夜，磷酸盐吐温缓冲液清洗3次，加入二抗室温孵育2 h，磷酸盐吐温缓冲液清洗3次，在Bio-Rad凝胶成像系统中进行显色反应。每个实验重复3次。

6. 细胞划痕实验

将细胞按最大数量接种于12孔板中，24 h后用10 μl枪头按使用力度相同和划线粗细相同的原则对细胞以“|”方式进行划痕，磷酸盐缓冲液洗去悬浮细胞和细胞碎片，并在0、24、48、72 h拍照记录，实验重复3次。

7. RTCA

细胞用0.25%的胰酶消化后重悬，细胞计数后取一部分细胞稀释至1×104/ml，充分混匀后取200 μl细胞悬液加入到RTCA仪配套的细胞培养板中，按程序设置实验名称、细胞类型、初始数量、扫描方式和频率，启动实验程序直至实验结束，实验重复3次，并对实验结果进行比对和分析。

三、统计学处理

用SPSS 21.0对实验数据进行统计学分析。组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、重组真核表达载体pEBFP-PXN构建成功

以Hep G2细胞mRNA为模板经逆转录获得cDNA，经PCR反应获得PXN基因蛋白编码区，经Xho Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切后插入真核表达载体pEBFP-C1中，构建PXN基因真核表达载体pEBFP-PXN（图1A）。对pEBFP-PXN用Xho Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切进行鉴定（图1B），并对其进行DNA正反测序，结果证明PXN基因无点突变，正是所需重组质粒。

二、建立PXN基因高表达稳转细胞株

去内毒素的重组真核表达质粒pEBFP-PXN用脂质体法稳定性转染肝癌细胞Hep G2，并用G418药物筛选杀死未转染的肝癌细胞，当细胞形成单克隆集落时，在荧光显微镜下挑取细胞集落并扩大培养，对细胞进行荧光观察（图2）。蛋白免疫印迹法检测分析发现，单克隆稳转肝癌细胞内外源融合蛋白BFP-PXN高表达（图3A）。

三、PXN基因抑制肝癌细胞迁移并影响EMT标志蛋白表达

为研究PXN基因对肝癌细胞的作用，首先利用RTCA法对稳转肝癌细胞株的生长增殖速率进行测定，如图4所示，与对照细胞相比，稳转肝癌细胞株的生长增殖速率无显著变化（72 h：t = 0.438，P = 0.684），证明PXN基因基本不影响Hep G2肝癌细胞的生长增殖速率。然后，利用细胞划痕-愈合实验检测稳转肝癌细胞的迁移能力，结果发现高表达外源蛋白BFP-PXN的稳转株的细胞迁移能力降低（24 h：t = 5.177，P = 0.007;48 h：t = 8.307，P = 0.001;72 h：t = 5.498，P = 0.005），证明桩蛋白高表达可以抑制Hep G2肝癌细胞的迁移能力（图5）。同时，蛋白免疫印迹法分析发现，指示细胞间质化的标志蛋白N-Cadherin（t = 4.374，P = 0.049）和Vimentin（t = 10.672，P = 0.009）表达降低，而指示细胞上皮化的标志蛋白E-Cadherin表达升高（t = -10.223，P = 0.009）（图3B）。

讨论

桩蛋白是一种具有多结构域和多功能的黏着斑手脚架蛋白，可通过募集多种结构蛋白和信号分子参与细胞黏附、运动和信号转导。桩蛋白上有多个酪氨酸和丝氨酸残基参与磷酸化，与蛋白定位和生物学功能密切相关。研究发现，当整合素结合到细胞外基质（ECM）上可以促进桩蛋白的磷酸化水平，从而募集胞内多种蛋白包括FAK和Src结合到桩蛋白的N端，结合的FAK可磷酸化樁蛋白的Tyr31和Tyr118，Src可磷酸化Tyr88和Tyr118，使磷酸化的桩蛋白与下游靶蛋白p130cas作用，介导由ERK从胞外传导来的信号，最终影响细胞的黏附和迁移[3-4]。

在肿瘤细胞中，虽然桩蛋白磷酸化水平与癌细胞的转移能力呈正相关，但桩蛋白表达量与癌细胞的关系较为复杂[5-8]。Liu等[9]发现在宫颈癌中，桩蛋白表达上调与肿瘤病理分级高、淋巴管侵袭和淋巴转移密切相关，并认为这可能与桩蛋白调节抗凋亡蛋白BCL-2表达有关。这一结果与赵珊珊等在卵巢肿瘤中发现的结果极为类似[10]。另外，Shekhar等[11]也发现在口腔癌中，桩蛋白表达量与肿瘤发展和进程呈正相关。同样的，Zheng等[12]发现，在前列腺癌组织中，桩蛋白表达显著高于正常组织和良性前列腺增生组织，并与前列腺癌更容易发生淋巴结转移、耐化疗药物和术后浸润相关。但是，在前列腺癌细胞PC-3中，Sobkowicz等[13]发现用小干扰RNA（siRNA）敲低细胞内源性桩蛋白后，前列腺癌细胞的生长速度和转移侵袭能力未发生明显变化;在前列腺癌细胞LNCap中，siRNA敲低细胞内源性桩蛋白后，前列腺癌细胞的生长增殖速度和转移浸润能力增强，但其黏附能力并未发生显著变化。在乳腺癌细胞MDA-MB-231中，敲低内源性桩蛋白不影响细胞的增殖能力，但可以增强黏附力和降低细胞浸润能力[12]。综上所述，桩蛋白表达高低与肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭之间关系较为复杂，它在不同的肿瘤发生发展中具有不同的作用和功能，因此，要全面了解桩蛋白在肿瘤中的作用就需要在不同的肿瘤中用实验验证。

原发性肝癌是一种转移可能性大的恶性肿瘤，为正确认识桩蛋白在肝癌发生发展中的作用，本研究首先克隆了PXN基因蛋白编码区，并构建了真核表达质粒pEBFP-PXN及其稳转单克隆肝癌细胞株[14]。蛋白免疫印迹法分析发现，高表达外源PXN融合蛋白的肝癌细胞，其细胞增殖速率未发生显著改变，但细胞迁移能力明显受到抑制;同时，细胞内上皮化标志蛋白E-Cadherin表达显著升高，间质化标志蛋白N-Cadherin和Vimentin表达降低，这些结果说明桩蛋白高表达可以抑制肝癌细胞Hep G2的迁移能力，可以作为临床肝癌诊断和治疗的潜在靶标。

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（收稿日期：2019-05-12）

（本文編辑：杨江瑜）