鳖甲水溶性蛋白含量测定方法比较

翟 玲,夏 雨,杨艳芳,吴和珍,刘焱文,尤朋涛

(湖北中医药大学 中药资源与中药化学湖北省重点实验室,湖北 武汉430065)

鳖甲为鳖科动物鳖(Trionyx sinensisWiegmann)的背甲,具有滋阴潜阳、退热除蒸、软坚散结的作用。现代研究显示,鳖甲可预防或延缓早期肝纤维化的形成和发展[1],有抗肝纤维化以及抗肿瘤和免疫调节等作用,近年来鳖甲的药理研究也多集中在这些方面[2-3]。鳖甲富含多种常见的氨基酸[4],经煎煮后,起负抑制效应的大分子蛋白变性成为小分子肽类物质而发挥抑制肝星状细胞增殖作用[5]。动物药中蛋白、氨基酸的分析检测是迅速提升动物药研究水准和促进动物药资源开发利用的不二捷径[6],一种准确且恰当的分析方法是实现这一途径的前提。因此,探究测定鳖甲水溶性蛋白含量的方法对鳖甲药材的质量控制具有重要意义。当前有关鳖甲此方面的研究报道尚不多见。因此,本实验对其展开了初步研究。现代提取蛋白主要以有机溶剂和碱液为溶剂,产量虽高但对蛋白品质影响较大[7-8],而鳖甲的临床常用剂型为其水煎液。因此,本实验以水为溶剂。2015版《中国药典》共收载了6种测定蛋白含量的方法,其中Lowry(福林－酚试剂)法是蛋白中酪氨酸和色氨酸与试剂反应,受蛋白的氨基酸组成影响较大,双缩脲法本身灵敏度小且样品用量大,而本实验需得到准确高效的测定方法,但鳖甲水溶液中蛋白的具体组成成分尚不确定。因此,本研究采用其他4种不同的测定方法进行定量分析,以期达到实验目的。

1 材料

1.1 鳖甲饮片

鳖甲经湖北中医药大学吴和珍教授鉴定为鳖科动物鳖Trionyx sinensisWiegmann的背甲,经质量检测,符合2015版《中国药典》的规定。

1.2 仪器

千分之一电子天平(JA2003)：上海常衡电子科技有限公司；粉碎机(XL-04B)：广州市旭朗机械设备有限公司；超声仪(SK7200HP)：上海科导超声仪器有限公司；旋蒸机(RE-2000)：上海亚荣生化仪器厂；酶标仪、紫外分光光度计(SPARK 10M)：瑞士帝肯贸易有限公司；凯氏定氮仪(K9801)：上海析达仪器有限公司。

1.3 化学试剂

氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、浓硫酸、溴甲酚绿－甲基红指示剂、牛血清标准蛋白：国药集团化学试剂有限公司；BCA试剂盒、考马斯亮蓝试剂：南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 样品液制备

将鳖甲粉碎,过2号筛,精密称取1.00 g鳖甲粉末,加水50 mL,超声提取两次,每次30 min,减压抽滤,合并两次滤液,经浓缩后于50 mL的容量瓶定容置于4℃备用。蛋白标准溶液：精密称取2.00mg牛血清标准蛋白粉末溶于1 mL的水中。

2.2 试剂的配制

BCA工作液：按照BCA Reagent A：BCA Reagent B＝100∶1的比例混合后置于4℃备用。考马斯亮蓝显色液：按照考马斯亮蓝储备液∶双蒸水＝1∶4的比例进行配制。

2.3 定量分析

2.3.1 凯氏定氮法 凯氏定氮法被国内外视为法定的标准检验方法[9-10],可作为衡量其他的蛋白定量方法准确性的标准。其通过测定样品中总氮的含量换算出样品中蛋白含量,测定步骤依次为样品的消化、蒸馏、吸收及滴定。样品的消化：在消化瓶中加入10 mL样品、0.2 g硫酸铜粉末、6 g硫酸钾粉末、10 mL浓硫酸和沸石后于通风橱中消化；蒸馏：将10mL消化好的消化液和10mL 30%的氢氧化钠进行水蒸气蒸馏；吸收：以溴甲酚绿－甲基红为指示剂用2%的硼酸溶液吸收蒸馏出的氨；滴定：用0.025 mol/L硫酸标准溶液进行滴定吸收了氨的硼酸溶液[11]。以2 g/L的蛋白标准蛋白对凯氏定氮法进行校正,测定表1中3个不同浓度样品溶液的蛋白含量,重复测定3次。见表2。

表1 凯氏定氮法测定蛋白含量的溶剂配加

2.3.2 考马斯亮蓝G-250染色法 考马斯亮蓝G-250染料与蛋白中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基相结合,颜色发生改变,且最大光吸收由465nm变成595nm,符合比尔定律(Beer),根据试剂盒的说明书按表1将各组试液加入96孔板中,用酶标仪于595 nm处测定吸光度,并计算蛋白含量,实验独立重复3次。

表2 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白含量的溶剂配加

蛋白浓度(g/L)＝(测定OD值－空白OD值)/(标准OD值－空白OD值)∗标准品浓度(0.563 g/L)。

2.3.3 BCA法 BCA法蛋白定量的原理为二价铜离子(Cu2＋)在碱性条件下被蛋白的肽键还原成一价铜离子(Cu＋),还原后的铜离子浓度与溶液中所含蛋白浓度成正比。Bicinchonininc Acid与一价铜离子络合形成的紫色复合物在562 nm处有强烈的吸光性。将蛋白标准溶液按表3稀释,取不同浓度稀释液各25μL分别加入96孔板中,每孔加入200μL工作液后立即混匀,37℃反应30 min后用酶标仪于562 nm波长处测定吸光度,重复测定3次。所得标准曲线见图1。

表3 BCA法测定蛋白含量的标准曲线溶剂配加

图1 BCA法标准曲线

求得吸光度y与浓度x(mg/mL)的回归方程y＝0.907 5x＋0.036 66,相关系数r＝0.999。结果表明,蛋白浓度在0～2 mg/mL范围内,样品溶液吸光度与蛋白浓度呈良好线性关系。按表1配制样品溶液后于562nm波长处测定吸光度,重复测定3次。

2.3.4 紫外吸收法 蛋白分子中,络氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白具有吸收紫外光的性质。吸收峰在280 nm处,样品溶液吸光度与蛋白含量成正比,用紫外分光光度计测定得到标准曲线后,通过标准曲线可测定得到样品溶液的蛋白浓度。按表4制作标准曲线,重复测定3次。所得标准曲线见图2。

表4 紫外吸收法测定蛋白含量的标准曲线溶剂配加

图2 紫外分光光度测定标准曲线

求得吸收度y与浓度x(mg/mL)的回归方程y＝0.146 5x＋0.012 2,相关系数r＝0.991 7。结果表明,蛋白浓度在0～2mg/mL范围内,样品溶液吸光度与浓度呈良好线性关系。按表1配制样品溶液后于280nm波长处测定吸光度,重复测定3次。

3 结果

3.1 凯氏定氮法对样品的测定

测定用时8～10 h,消耗样品量较多,操作步骤繁琐,尽管凯氏定氮法结果准确可靠,但目前进行蛋白定量并不是首选。将凯氏定氮法所测得的结果作为参考值,其他蛋白定量法测定所得到的结果与其对比,在保证测定结果准确的前提下得到高效的测定鳖甲水溶性蛋白含量的测定方法。凯氏定氮法测定3个不同浓度样品溶液中蛋白含量的结果见表5。

表5 凯氏定氮法测定样品中蛋白含量结果

3.2 考马斯亮蓝G-250染色法对样品的测定

考马斯亮蓝G-250染色法对样品中蛋白含量的检测结果及其测定结果与凯氏定氮法的测定结果间的偏差见表6。蛋白浓度＜0.5 mg/mL时偏差≈32%,蛋白浓度在0.5 mg/mL～1mg/mL范围内时偏差≈31%,蛋白浓度在1 mg/mL～1.5 mg/mL内时偏差≈33%。此法测定用时5～10 min。相比凯氏定氮法,考马斯亮蓝G-250染色法测定用时短、消耗样品少、对操作环境无特殊要求,两种方法测定结果间的偏差＞30%。

表6 考马斯亮蓝G-250染色法测定样品中蛋白含量结果

3.3 BCA法对样品的测定

样品按表1分组,通过BCA法测定,所得数据带入标准回归方程所得结果及其测定结果与凯氏定氮法的测定结果间的偏差见表7。蛋白浓度＜0.5 mg/mL时偏差≈16%,蛋白浓度在0.5 mg/mL～1 mg/mL范围内时偏差≈11%,蛋白浓度在1 mg/mL～1.5 mg/mL范围内时偏差＜5%。此法测定用时40～50 min,相比凯氏定氮法,BCA法测定用时短、消耗样品少、操作简单,测定结果与凯氏定氮法的测定结果间有较小的偏差。

表7 BCA法测定样品中蛋白含量结果

3.4 紫外吸收法对样品的测定

紫外吸收法于280nm波长处对样品中蛋白含量的测定结果及其测定结果与凯氏定氮法的测定结果间的偏差见表8。蛋白浓度＜1.5 mg/mL时,偏差＞96%,且两法测定结果间的偏差随测定样品溶液蛋白浓度的减小而增大。因此,紫外吸收法虽有测定快速、样品消耗少、样品可回收、操作环境无特殊限制的优点,但不适于鳖甲水溶性蛋白含量的测定。

表8 紫外吸收法测定样品中蛋白含量结果

4 讨论

考马斯亮蓝G-250染色法、BCA测定法、紫外吸收法3种蛋白定量法都是根据一定波长下,样品吸光度的改变与蛋白浓度有直接的关系,从而测定相应波长下样品吸光度的变化值可计算出样品中蛋白浓度。这3种方法都是快速测定蛋白含量的方法,且分别与凯氏定氮法对比：考马斯亮蓝G-250染色法消耗少量样品,用时短,操作简单,两方法的测定结果差异大,原因可能是样品中蛋白的碱性氨基酸残基和芳香族氨基酸含量较少或与标准蛋白不同[12]；BCA测定法消耗少量样品,用时极短,操作简单,两方法的测定结果相近,两法测定结果存在较小差异原因可能是样品液中所含少量的杂质、钙离子、脂质[13]、EDTA[14]等；紫外吸收法测定的样品可完全回收,用时短,操作简单,两方法的测定结果差异极大,原因可能是所测样品中蛋白与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异太大[15],且样品溶液中含的杂质较多。

BCA法测定蛋白含量所用的试剂单一、产生复合物稳定、不受TritonX-100及SDS等表面活性剂的影响,影响因素少且灵敏,在近些年的研究中体现出其优势,有望替代最常用的Lowry法。本研究中BCA法测定结果与凯氏定氮法的测定结果间差异小,所以综合以上,对比凯氏定氮法、考马斯亮蓝G-250染色法、紫外吸收法3种蛋白测定方法,当鳖甲水提溶液中所含成分尚不明确的情况下,比较适合用BCA法对鳖甲水提溶液中蛋白含量进行快速测定。目前鳖甲的活性成分尚未明确,可控指标难以统一,但在鳖甲化学成分及抗肝纤维化等研究中,鳖甲药材中的蛋白、多肽、氨基酸则至关重要,因此,鳖甲蛋白含量及其测定方法在鳖甲质量控制的研究中必不可少。对于以蛋白含量作为评价鳖甲药材质量的指标,通过BCA法测定其蛋白含量的具体标准仍需进一步深入研究。