蛴螬质量标准研究

赵 磊,王路宏,孙艳涛

(1.四平市食品药品检验所,吉林 四平136000；2.吉林师范大学 化学学院,吉林 四平136000)

蛴螬为金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子Holotrichia diomphaliaBates的干燥幼虫[1]。民族药中朝鲜族的习用药材,朝药图志收载的功能主治具有破血、利水消肿,常用于太阴人跌打损伤、羸瘦腹满、癥瘕、经闭、浮肿等病症[2]。蛴螬收载于《中国药典》2015版四部成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片项下,《中国药典》2015年版一部中收载的大黄虫丸、大黄虫胶囊、大黄虫片处方中均用到蛴螬[3-4]。

有文献报道,蛴螬采用氨基酸为对照进行薄层色谱鉴别进行定性试验[5]。但针对蛴螬薄层色谱鉴别采用传统的展开剂展开后喷茚三酮显色方法,经过系统的试验研究,发现采用调整展开剂比例并加入茚三酮作为展开剂系统的方法,能使方法展开效果更清晰,操作简单。初步研究确定蛴螬中含有尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷等成分[6-7],而肌苷在《中国药典》2015版二部收载的剂型有肌甘口服液、肌苷片、肌苷注射液、肌苷胶囊、肌苷葡萄糖注射液、肌苷氯化钠注射液、注射用肌苷。肌苷用于白细胞或血小板减少症,各种急慢性肝脏疾患、肺原性心脏病等心脏疾患；中心性视网膜炎、视神经萎缩等疾患[8]。而蛴螬具有破血祛瘀、散结通乳、明目等功效,用于胸肋瘀血疼痛、丹毒、疮疡、痔瘘、目中翳膜。肌苷与蛴螬治疗作用具有相似性,含量控制应以肌苷为控制指标,具有专属性。并且蛴螬的来源为春、夏二季捕捉,用沸水烫死,晒干或烘干。肌苷的性质具有水溶性,采用肌苷为目标测定成分,进行含量控制,亦能够有效反映蛴螬来源处理方法的控制指标。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；2001B型系列超纯水器(北京普析通用仪器有限责任公司)；电子天平BT125D型万分之一分析天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂制造)；SK5200 H超声波清洗器(300 W 60 Hz,上海科导仪器有限公司)。

1.2 试药

亮氨酸对照品批号：110876-200204,缬氨酸对照品批号：110874-201204,丙氨酸对照品批号：140680-201604,肌苷对照品(批号140669-201305；含量为99.1%；使用前不需干燥)均购于中国食品药品检定研究院；蛴螬(收集10批药材,规定编号为qc1-qc10经鉴定均为正品蛴螬)；乙醇、正丁醇、冰醋酸、茚三酮均为为分析纯；甲醇为色谱纯；水为超纯水；色谱柱为Sepax BR-C18(4.6mm×250mm,5μm)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别方法与结果

2.1.1 蛴螬对照药材及供试品溶液制备 取蛴螬粉末0.5g,加稀乙醇10mL,超声处理30min,滤过滤液作为供试品溶液。另取亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸对照品适量,加稀乙醇制成每1mL各含1mg的混合溶液,作为对照品溶液。

2.1.2 薄层色谱条件 照薄层色谱法(中华人民共和国药典2015版四部通则0502)试验,吸取上述对照品溶液1μL、供试品溶液2～5μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇－冰醋酸－水－2%茚三酮乙醇溶液(3∶1∶1∶0.25)为展开剂,展开,取出,晾干,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。结果见图1。

图1 蛴螬薄层色谱鉴别

2.2 高效液相色谱法

2.2.1 肌苷对照品溶液制备 取肌苷对照品适量,精密称定,加水制成50μg/mL的溶液,即得。

2.2.2 供试品溶液制备 取本品粉末(过三号筛)约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入水20 mL,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,用水补足减失重量,摇匀,置离心管中,离心(转速为5 000转/min)5 min,滤过,取续滤液,即得。

2.2.3 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇－水(5∶95)为流动相,检测波长为260 nm。流速1.0 mL·min-1；检测器：紫外(二极管阵列检测器)；进样量：10μL。对照品、供试品色谱见图2、图3。

图2 对照品色谱

图3 供试品色谱

2.3 方法学考查

2.3.1 线性关系 精密称取肌苷对照品10.08 mg,置20mL量瓶中用水溶解并定容至刻度,作为对照品储备液(504μg/mL)。精密吸取对照品储备液0.05 mL、0.3 mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL分别置10 mL容量瓶中用水稀释并定容至刻度,摇匀,即得(此溶液浓度分别为2.52μg/mL、15.12μg/mL、25.2μg/mL、50.4μg/mL、100.8μg/mL、252μg/mL)。分别取10μL注入液相色谱仪,按照上述色谱条件对样品进行测定,以峰面积为纵坐标(Y),进样浓度为横坐标(X),峰面积对浓度作线性回归方程。得回归方程,Y＝15.127X＋2.096 5,R2＝0.999 9,表明肌苷在2.52～252μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 取肌苷对照品溶液浓度为50.4μg/mL,精密吸取对照品溶液10μL,注入液相色谱仪,连续进样6次,测定,即得。测定其峰面积,结果表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液(qc1),按照色谱条件测定,分别于配制后的0 h、3 h、9 h、12 h、15 h、20 h,精密吸取10μL,注入液相色谱仪,记录峰面积,结果肌苷峰面积的RSD(n＝6)为0.9%,结果表明供试品溶液在20 h内稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 取样品粉末6份(qc1),分别按照供试品制备供试品溶液。精密吸取10μL,注入液相色谱仪,记录峰面积,计算肌苷含量,RSD为1.2%,实验结果表明该方法重复性良好。

2.3.5 回收率试验 取已知含量的供试品粉末6份(qc1),每份约0.5g,置20mL量瓶中,精密加入与其含有量相应对的照品溶液适量,加水定容至刻度,分别按照供试品制备方法制备供试品溶液,按色谱条件测定,记录峰面积,计算回收率(n＝6),计算加标回收率,结果平均回收率为94.9%,RSD为1.3%,说明回收良好。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果 (n＝6)

2.3.6 耐用性试验 由于不同生产厂家不同牌号的色谱柱存在填料及性能上的差异,为考察拟订方法的可行性及通用性,对3种品牌的色谱柱a：Sepax BR-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)、b：Waters HSS T 3(4.6 mm×250 mm,5μm)、c：InertsilODS-SP C18(4.6 mm×250mm,5μm)在3台液相色谱仪(d：Agilent 1260型高效液相色谱仪、e：Thermo Ultimate 3000型液相色谱仪、f：岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪)上进行了比较。试验得到的供试品色谱图,主峰峰形对称,主峰与杂质峰分离度良好,说明该方法具有较好的耐用性,理论塔板数暂定为不得低于3 000。结果见表2。

表2 耐用性试验

2.3.7 样品含量测定 按上述色谱条件测定10批供试品溶液,蛴螬中肌苷的百分含量见表3。

表3 样品含量测定结果

通过10批次供试品肌苷测定结果,按干燥品计,平均含量为0.084 4%,按平均值的80%制定,限度定为0.060%。10批样品含量测定中有2批不合格。

3 讨论

3.1 薄层色谱

薄层鉴别传统氨基酸展开剂均采用正丁醇∶冰醋酸∶水三相,调整不同比例进行展开,采用喷以茚三酮溶液。改良的展开剂为正丁醇－冰醋酸－水－2%茚三酮乙醇溶液(3∶1∶1∶0.25),加入显色剂,避免喷显色剂,斑点散开现象。提取溶剂考察采用乙醇、稀乙醇、水提取结果采用稀乙醇提取效果好。温、湿度考察过程中,考虑由于实验时的温度、湿度会影响薄层色谱结果,我们采取高温高湿和低温低湿的实验环境考察温度和湿度对薄层色谱的影响,结果无明显差别。

3.2 含量测定

考察采用水、20%甲醇、0.1%冰醋酸作为提取溶剂,考察振摇、超声、回流提取方式,结果发现采用水提,超声处理提取效果较好,操作方法简单。考察提取10 min、20 min、30 min,结果发现超声30 min提取效果好。但由于粉碎后蛋白质成分多,提取溶液不易滤过,而采用静止过夜后才能滤过。为了减少分析测试时间,考察离心3 000 rpm·min-1、5 000 rpm·min-1、8 000 rpm·min-1、10 000 rpm·min-1、12 000 rpm·min-1,结果发现3 000rpm·min-1仍不易过滤,超过5 000 rpm·min-1后可以滤过。离心时间考察5 min、8 min、10 min,结果5 min离心就能够达到较好的滤过效果,因此离心时间定为5 min。