鱼金注射液对大鼠脾胃功能的影响

姜 嫄,张长海

(1.黔西南民族职业技术学院,贵州 兴义562400；2.黔西南州人民医院,贵州 兴义562400)

鱼金注射液(YJI)是一种纯中药注射剂[1],由鱼腥草、金银花提取制成,具有抗炎、解热及抗菌等作用。在临床上疗效可靠,可用于急性上呼吸道感染、急性支气管炎、支气管肺炎等病的治疗,显著改善发热、咳嗽、气急等症状,其主要用药方式包括肌肉注射、穴位注射和雾化吸入[2-4]。目前,尚无针对鱼金注射液对机体各系统脏器功能影响的报道。有研究通过检索2010年底前相关文献分析鱼金注射液用药情况、不良反应涉及系统和表现对其安全性与有效性进行评价,结果显示,共获取有效文献69篇,1篇横断面研究和临床随机对照试验报道提示鱼金注射液具有较好的临床疗效,25例报道不良反应,分别表现为皮疹12例,过敏性休克4例,注射部位疼痛3例,其他输液或过敏反应6例[5]。但由于资料所限,仍不足判定鱼金注射液有效性及安全性。

脾脏是机体重要的免疫器官,内含大量B淋巴细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞,是机体参与细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫的重要场所[6]。同时,脾脏也是红细胞、白细胞和粒细胞生成、贮存与成熟的主要器官。鱼金注射液功效与其主要成分清热解毒类中药鱼腥草和金银花调节机体免疫功能相关,研究表明,二者均可通过增强白细胞吞噬能力、促进干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)表达[7],增强机体免疫功能。有研究者将一定比例的鱼腥草与吉富罗非鱼构成共生系统,发现其可显著提高吉富罗非鱼胆汁液及血清中金属硫蛋白(MT)、免疫球蛋白(IgM)、转铁蛋白(TRF)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和表皮生长因子(EGF)的含量,从而提高吉富罗非鱼非特异免疫能力,并发现这种效应与鱼腥草根系通过化感作用分泌的黄酮类等物质相关[8-9]。鱼腥草提取物可通过增强脾脏Th1类细胞因子IFN-γ、IL-12基因表达,抑制Th2类细胞因子IL-4基因表达促进机体细胞免疫,调节感染鸡毒支原体鸡胚模型免疫功能,抑制鸡毒支原体感染[7]。研究表明,每日灌胃给予大鼠金银花煎剂2.5 g·kg-1,2周,可显著提高大鼠腹腔巨噬细胞吞噬率及吞噬指数,能增强机体脾脏Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α能力及淋巴细胞转化率,增强机体的细胞免疫功能,增强机体的抗病毒,抗胞内菌感染的能力[10]。金银花多糖可提高免疫低下小鼠的脾脏指数,增加血清溶血素抗体生成及IL-2含量,增强环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的免疫功能[11]。金银花黄酮能显著提高免疫抑制小鼠的脾脏器指数、脾脏超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力,明显降低脾脏单胺氧化酶和丙二醛含量,具有良好的免疫调节功能[12]。胃是机体重要的消化器官。中医认为胃主受纳与腐熟,赖于胃脘之阳的温化,过用寒凉之品则易损伤胃阳,使胃失和降而致胃脘痞满、消化不良等。鱼金注射液成分金银花、鱼腥草均属于清热解毒类中药,性偏寒。本实验以临床等效用量50、100倍的鱼金注射液分别作为低、高剂量组,以大鼠为研究对象,探讨鱼金注射液对大鼠脾、胃功能及形态的影响,为鱼金注射液临床使用剂量、时间等提供相应实验依据。

1 材料与仪器

1.1 动物

清洁级SD大鼠共60只,雌雄各半,体重：(80±20)g,购自重庆腾鑫生物技术有限公司,动物许可证号SCXK(军)2012-0011。

1.2 药品

鱼金注射液产自朗致集团万荣药业有限公司(国药准字Z14021872,批号17060621E)。

1.3 试剂与仪器

采血针(南昌市赣达医疗器械有限公司,批号：170905)；采血管(南昌市赣达医疗器械有限公司,批号180529)；采血管(江苏康健医疗用品有限公司,批号171012)；多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司,批号20180112)；高效切片石蜡(上海华灵康复器械厂,批号20180118)；无水乙醇(AR级)(江苏海兴化工有限公司,批号GB678-90)；PBS磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司,批号ZLI-9062)；二甲苯(AR级)(天津致远化学试剂有限公司,批号20180110)；伊红染液(珠海贝索生物技术有限公司,批号BA-4099)；苏木素染液(珠海贝索生物技术有限公司,批号BA-4097)；中性树胶(国药集团化学试剂有限公司,批号20171009)；盐酸(AR级)(成都市科龙化工试剂厂,批号20180118)；浓硫酸：(AR级)(成都市科龙化工试剂厂,批号20180119)；重铬酸钾：(AR级)(成都市科龙化工试剂厂,批号20180120)；xt2000i血常规仪(西斯美康)；u5800全自动生化仪(贝克曼)；组织包埋盒(江苏世泰实验器材有限公司,批号31050102W)；R35刀片(日本羽毛安全剃刀株式会社)；BMJ-Ⅲ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)；转轮式切片机(德国徕卡-2016)；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；BA400Digital数码三目摄像显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)；Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(美国 Media Cybernetics公司)。

2 方法

2.1 动物分组和给药

60只清洁级SD大鼠随机分为3组,每组20只,雌雄各半。分别为：正常组、鱼金注射液低剂量组(2 mL·kg-1)、鱼金注射液高剂量组(4mL·kg-1),正常组灌胃给予生理盐水2mL·kg-1,给药组分别灌胃给予鱼金注射液2 mL·kg-1、鱼金注射液4mL·kg-1,每天灌胃给药1次,连续给药5周。

2.2 一般情况观察和体重测定

给药期间观察大鼠精神状态、毛发质量、活动情况、进食情况,监测大鼠体重变化。并选取给药第1、7、14、21、28、35 d大鼠体重做柱状图比较每组各时间点体重差异。

2.3 脾脏指数测定

取大鼠新鲜脾脏,使用生理盐水将其冲洗干净,分别称取脾脏湿重,计算脾脏指数。脾脏指数＝脾重(mg)/体重(g)。

2.4 血常规及血清血糖、总胆固醇、甘油三脂含量检测

摘眼球采集大鼠血液,全自动血球计数仪检测大鼠全血红细胞 (RBC)、血红蛋白 (Hb)、红细胞压积 (HCT)、白细胞 (WBC)、血小板 (PLT)计数；以2 500 rpm·min-1,4℃离心15 min后吸取血清,全自动生化仪检测大鼠血清血糖(GLu)、总胆固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)含量。

2.5 脾脏和胃组织病理检测

取大鼠新鲜脾脏和胃组织适当大小迅速放入4%多聚甲醛中,固定,石蜡包埋,切片,HE染色,采用BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统对切片进行图像采集,每张切片先于40倍下观察全部组织,观察大体病变,选择要观察的区域采集100、400倍图片并分析。

2.6 统计学方法

所有数据采用SPSS 18.0统计软件进行分析,组间比较采用t检验,实验结果以均数加减标准差(±s)表示,P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 体重及一般情况

与正常组比较,鱼金注射液低、高剂量组雄性与雌性大鼠各时间段体重均无统计学意义(P＞0.05),具有可比性,见图1。鱼金注射液低、高剂量组大鼠被毛柔顺有光泽,反应灵敏,活动度可,体重增加明显,食欲良好,大便呈颗粒状,与正常组大鼠无明显差异。

图1 鱼金注射液对大鼠体重变化的影响

3.2 食物利用率

与正常组比较,鱼金注射液低、高剂量组雄性与雌性大鼠各时间段食物利用率比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。见图2。

图2 鱼金注射液对大鼠食物利用率的影响

3.3 脾脏器指数检测结果

与正常组比较,鱼金注射液低、高剂量组雄性与雌性大 鼠脾脏指数均无统计学意义(P均＞0.05)。见表1。

表1 鱼金注射液对大鼠脾脏指数影响 (±s,n＝10)

表1 鱼金注射液对大鼠脾脏指数影响 (±s,n＝10)

组别 剂量(mL·kg-1) 雄性体重(g) 脾脏指数(mg·g-1)雌性体重(g) 脾脏指数(mg·g-1)正常组 － 213.69±27.82 2.61±0.31 209.56±24.65 2.55±0.19鱼金注射液低剂量组 2 210.78±18.54 2.66±0.37 203.31±21.69 2.58±0.27鱼金注射液高剂量组 4 212.42±15.55 2.71±0.42 210.62±18.05 2.67±0.41

3.4 血清血糖、总胆固醇、甘油三酯检测结果

与正常组比较,鱼金注射液低高剂量组雄性与雌性大鼠血清血糖(GLu)、总胆固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)含量均无统计学意义(P均＞0.05)。见表2。

表2 鱼金注射液对大鼠血清血糖、总胆固醇、甘油三酯影响 (±s,mmol·L-1,n＝10)

表2 鱼金注射液对大鼠血清血糖、总胆固醇、甘油三酯影响 (±s,mmol·L-1,n＝10)

组别 剂量(mL·kg-1)雄性CHOL TG GLU雌性CHOL TG GLU正常组 － 1.81±0.06 1.50±0.18 10.34±1.29 1.81±0.15 1.58±0.32 10.14±1.39鱼金注射液低剂量组 2 1.86±0.08 1.50±0.07 10.19±0.86 1.74±0.20 1.60±0.51 10.95±2.27鱼金注射液高剂量组 4 1.85±0.11 1.49±0.15 10.65±0.87 1.82±0.15 1.65±0.29 10.91±2.94

3.5 血常规检测结果

与正常组比较,鱼金注射液低高剂量组雄性与雌性大鼠红细胞 (RBC)、血红蛋白 (Hb)、红细胞压积 (HCT)、白细胞 (WBC)、血小板 (PLT)计数均无统计学意义(P＞0.05)。见表3、表4。

表3 鱼金注射液对大鼠血细胞计数影响 (±s,n＝10)

表3 鱼金注射液对大鼠血细胞计数影响 (±s,n＝10)

组别 剂量(mL·kg-1)雄性RBC(∗10^12·L-1)HGB(g·L-1)HCT(%)雌性RBC(∗10^12·L-1)HGB(g·L-1)HCT(%)正常组 － 6.23±0.20 157.10±7.39 46.70±4.67 6.84±0.74 151.40±9.58 46.50±3.21鱼金注射液低剂量组 2 6.18±0.58 155.90±6.08 49.30±4.99 6.86±0.64 150.20±5.12 46.20±5.01鱼金注射液高剂量组 4 6.39±0.33 156.80±4.76 47.60±4.27 6.93±0.45 149.80±6.00 46.30±4.27

表4 鱼金注射液对大鼠血细胞计数影响 (±s,n＝10)

表4 鱼金注射液对大鼠血细胞计数影响 (±s,n＝10)

组别 剂量(mL·kg-1) 雄性WBC/109·L-1 PLT/109·L-1雌性WBC/109·L-1 PLT/109·L-1正常组 － 11.16±0.87 829.10±71.58 11.40±0.77 810.80±94.35鱼金注射液低剂量组 2 10.85±0.45 823.40±49.57 11.23±0.92 818.00±51.08鱼金注射液高剂量组 4 11.10±0.56 847.30±87.45 10.80±0.63 819.50±66.80

3.6 脾组织病理检测结果

正常组雄雌性大鼠脾脏：脾脏被膜完整,红髓和白髓分界较为清晰,白髓区域脾小结可见生发中心较明显,淋巴细胞排列较疏松,巨噬细胞增多,呈现“星空现象”,即有大而不规则、浅染的巨噬细胞吞噬细胞碎片形成,核分裂象增多,淋巴细胞数量减少；红髓区域内未见明显的炎细胞浸润,巨噬细胞增多；其他未见明显病理变化。鱼金注射液低剂量组脾脏：脾脏被膜完整,红髓和白髓分界较为清晰,白髓区域脾小结可见生发中心较明显,淋巴细胞排列较疏松,巨噬细胞增多,呈现“星空现象”,即有大而不规则、浅染的巨噬细胞吞噬细胞碎片形成,核分裂象增多,淋巴细胞数量减少；红髓区域内可见少量嗜酸性或中性粒细胞浸润,巨噬细胞明显增多；其他未见明显病理变化。鱼金注射液高剂量组雄性及雌性大鼠脾脏：脾脏被膜完整,红髓和白髓分界较为清晰,白髓区域脾小结可见生发中心较明显,淋巴细胞排列较疏松,巨噬细胞增多,呈现“星空现象”,即有大而不规则、浅染的巨噬细胞吞噬细胞碎片形成,核分裂象增多,淋巴细胞数量减少；红髓区域内少量中性粒细胞浸润,巨噬细胞增多；其他未见明显病理变化。鱼金注射液低高剂量组雄性及雌性大鼠脾脏组织镜下所见与正常组比较无明显差异。见图3、图4。

图3 鱼金注射液对雄性大鼠脾组织病理检测(HE染色)结果左(×100)、右(×400)

图4 鱼金注射液对雌性大鼠脾组织病理检测(HE染色)结果左(×100)、右(×400)

3.7 胃组织病理检测结果

如图5、图6所示,正常组雄性及雌性大鼠胃组织可见纤维组织增生及少量炎细胞浸润；黏膜肌层组织松散,其他未见明显病理变化。鱼金注射液低剂量组雄性及雌性大鼠胃：黏膜单层柱状上皮、固有层及黏膜肌层结构完好,无坏死脱落、增生肠化及鳞状化生；固有层内部分壁细胞空泡变性,未见明显的纤维组织增生及炎细胞浸润；其他未见明显病理变化。鱼金注射液高剂量组雄性及雌性大鼠胃：黏膜单层柱状上皮、固有层及黏膜肌层结构完好,无增生肠化及鳞状化生；固有层内部分壁细胞空泡变性,部分细胞坏死,未见明显的纤维组织增生及炎细胞浸润；黏膜下层可见中度水肿；其他未见明显病理变化。见图5、图6。

图5 鱼金注射液对雄性大鼠胃组织病理检测(HE染色)结果左(×100)、右(×400)

图6 鱼金注射液对雌性大鼠胃组织病理检测(HE染色)结果左(×100)、右(×400)

续图6 鱼金注射液对雌性大鼠胃组织病理检测(HE染色)结果左(×100)、右(×400)

4 讨论

关于鱼金注射液中药制剂研究截止目前为止只有药效的研究并没有关于毒性研究的报道。由于效－毒二重性是药物作用的基本特性 因此笔者认为有必要进行鱼金注射液“功效－毒性”相关性的研究,即在已经进行其功效研究的同时重点考察其毒副作用的表达,不能孤立地“就功效论功效,就毒性论毒性”。鱼金注射液是鱼腥草与金银花提取而成的复方注射制剂,功效清热解毒,与调节机体免疫功能密切相关[7-12]。脾脏是机体最大的免疫器官,免疫器官的质量在一定程度上可以反映免疫器官内的淋巴细胞数量,从而间接地了解体内淋巴细胞总体水平[13]。实验结果显示,鱼金注射液低、高剂量组雄性与雌性大鼠脾脏指数与正常组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。HE染色病理结果显示,正常组雌性及雄性大鼠脾脏被膜完整,红髓和白髓分界较为清晰,白髓区域脾小结可见生发中心较明显,淋巴细胞排列较疏松,巨噬细胞增多,呈现“星空现象”,即有大而不规则、浅染的巨噬细胞吞噬细胞碎片形成,核分裂象增多,淋巴细胞数量减少；红髓区域内未见明显的炎细胞浸润,巨噬细胞增多；其他未见明显病理变化。鱼金注射液低、高剂量组雄性及雌性大鼠脾脏病理变化与正常组无明显差异。鱼金注射液低、高剂量组雄性与雌性大鼠RBC、Hb、HCT、WBC、PLT计数比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。另外,本试验部分动物脾脏组织均出现不同程度的脾小结内淋巴细胞减少,巨噬细胞增多,少量中性粒细胞或嗜酸性粒细胞浸润,可能是由于环境等因素所引起的应激反应,为非特异性病变。

胃是机体重要的消化器官。中医认为胃主受纳与腐熟,赖于胃脘之阳的温化,过用寒凉之品则易损伤胃阳,使胃失和降而致胃脘痞满、消化不良等。鱼金注射液成分金银花、鱼腥草均属于清热解毒类中药,性偏寒。本实验鱼金注射液低、高剂量组分别相当于临床等效用量的50、100倍,用药5周后各项指标显示：鱼金注射液低、高剂量组雄性与雌性大鼠被毛柔顺有光泽,反应灵敏,活动度可,食欲良好,食物利用随鼠龄增长呈下降趋势,但各时间段组间食物利用率比较差异均无统计学意义(P＞0.05,见图2),体重增加明显,且组间无统计学意义(P＞0.05,见图1),大便呈颗粒状,血清GLu、CHOL、TG含量均无统计学意义(P＞0.05,见表2),与正常组大鼠无明显差异,表明各组大鼠生长状态良好。正常组雄性及雌性大鼠胃组织可见纤维组织增生及少量炎细胞浸润,黏膜肌层组织松散,这与鱼金注射液高剂量组雄性及雌性大鼠胃黏膜下层所见中度水肿均考虑为灌胃所造成的物理损伤。另外,本试验光镜观察部分动物胃组织可见少量胃腺内壁细胞空泡变性等病理改变,固有层中少量炎细胞浸润,细胞内可见嗜碱性颗粒存在,可能为解剖时动物禁食不够,导致肝脏内肝糖原含量过高导致。

本实验分别灌胃给予SD大鼠别相当于人体推荐剂量50倍和100倍的鱼金注射液,持续5周,结果未见脾胃功能发生明显异常改变,表明鱼金注射液安全性较佳,但就其调节机体免疫功能来说,本课题将深入研究鱼金注射液对感染模型脾脏各项指标的影响观察其具体机制。此课题的开展不仅填补了鱼金注射液在运用中对毒副作用说明的缺失,同时也有利于此药在临床运用中的标准化,为鱼金注射液临床使用剂量、时间等提供实验依据,为鱼金注射液在临床上的推广应用提供理论基础。