针灸通督法联合药物治疗缺血性卒中的疗效及对预后的影响

花红兵，钱福文，郑炜贞

(1.江苏省如东县中医院，江苏 226400；2.四川省广元市中医院，广元 628000；3.江苏省南通市第一人民医院，南通 226001)

缺血性卒中是世界范围内一种严重危害人类身体健康的心脑血管疾病，具有较高的致死率和致残率，给患者造成极高的经济负担，且其发病率也呈逐年上升的趋势[1-3]。缺血性卒中的病理基础是各种原因造成的局部脑供血动脉狭窄或阻塞，最终引起其供血部位脑组织的缺血缺氧性坏死，根据病变发生的脑组织部位可伴有不同的神经功能缺损症状[4-6]。根据最近的流行病学调查显示，中国目前约有700万脑梗死患者，其中约70%患者伴有较严重的身体功能障碍[7]。虽然患病人数众多，但是现今脑梗死疾病仍缺乏有效的治疗手段，组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)仍是目前唯一被美国FDA认可的治疗药物。但是其非常严格的4.5 h治疗窗给其临床应用带来了极大的限制。因此寻找新的与缺血性卒中有关的治疗策略是当今生命医学科学领域一个极大的挑战及任务。最新的研究表明针灸治疗能够通过改变机体的血流速度、血管活性以及整体的循环状态而有效地改善突发脑血管意外患者的预后[8-9]。但现有的研究尚未阐明针灸通督法在缺血性卒中治疗中的作用机制及与预后的关系。CD40/CD40L是一对能够介导机体炎症反应的共刺激分子，参与调控缺血性卒中、动脉粥样硬化、自身免疫性疾病等众多炎性疾病的病理过程[10-14]。本研究给予缺血性卒中患者针灸通督法联合常规药物治疗，通过与常规药物治疗相比较，观察其是否能更有效地治疗缺血性卒中，并进一步分析其治疗作用机制是否与对CD40/CD40L系统的调节有关。

1 临床资料

1.1 一般资料

收集2016年1月至2017年1月在江苏省如东县中医院及四川省广元市中医院针灸脑病科收入的急性缺血性卒中患者100例。采用随机数字表法分为药物组和针药组。两组患者性别、年龄、血压等方面比较差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 诊断标准

参照中华医学会神经病学分会制定的《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[15]。

1.3 纳入标准

①符合缺血性卒中诊断标准；②发病超过24 h并经CT/MRI检查符合缺血性卒中的影像学诊断标准；③症状及体征符合中风的诊断标准；④年龄＜80岁；⑤生命体征平稳，家属或患者签署知情同意书。

1.4 排除标准

①颅内动脉狭窄已进展到慢性完全性闭塞；②大面积脑梗死导致的严重神经功能障碍；③对肝素、阿司匹林或其他抗血小板聚集类药物禁忌者；④已存在实质性脑损伤、脑肿瘤、脑寄生虫病患者；⑤伴有颅内动脉瘤，且不能提前或同时处理者；⑥严重心、肝、肾疾病者；⑦患者或患者家属不同意治疗。

2 治疗方法

2.1 药物组

患者入院后口服阿司匹林，每次100 mg，每日1次。连续服药14 d为1个疗程。

2.2 针药组

在对照组基础上采用针灸通督法。主穴取患者百会、大椎、风池、曲池、合谷、足三里、三阴交，配穴取太冲、太溪、丰隆、外关、间使、气海、血海，局部皮肤消毒后，选用0.30 mm×40 mm无菌针灸针对上述穴位进行针刺，得气后留针30 min。每日治疗1次，以14 d为1个疗程。

3 治疗效果

3.1 观察指标

3.1.1 外周血单个核细胞(PBMCs)提取

EDTA抗凝管采集患者外周静脉血5 mL，与5 mL PBS混匀后加入预先已加入5 mL Ficoll分离液的15 mL离心管中，2000 r/min离心30 min；用毛细吸管小心吸取白膜层细胞，置于另一15 mL离心管中，加入2～3倍体积的PBS，颠倒混匀，2000 r/min离心10 min，弃上清，留细胞沉淀用于后续实验。

3.1.2 实时荧光定量(Real-time)PCR

采用Real-time PCR法检测PBMCs中的CD40 mRNA表达水平。应用Prime Premier 5.0软件设计目的基因和内参基因引物。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下，CD40：正向5’-GCAGGCACAAACAAGACTGA-3’，逆向5’-TCGTCGGG AAAATTGATC TC-3’；GAPDH(内参)：正向5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，逆向5’-AG GTC CACC A CTGACACGTT-3’。

PCR反应参数：预变性95℃ 10 s，95℃变性5 s，60℃退火和延伸31 s，共40个循环，在延伸的过程中搜集荧光信号。于每次扩增的同时设置无cDNA的阴性对照，将PCR产物做熔解曲线，以证实以上PCR反应产物特异性良好。用7500 System SDS Software分析数据，统计2-ΔΔCt值以比较各组mRNA的表达。

3.1.3 Western blot

准备PBMCs蛋白样品，98℃变性5 min，冰上冷却，SDS-PAGE电泳后使用半干转膜系统进行转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h。一抗4℃孵育16～18 h，TBST洗涤10 min，3次。二抗室温(20～25℃)孵育1 h，TBST洗涤10 min，3次。加入高灵敏的LunimataTM Crescendo发光剂至PVDF膜，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系统进行拍照分析。

3.1.4 血浆细胞因子sCD40L、IL-6、IL-1β的检测

抽取静脉血5 mL，EDTA抗凝，3000 r/min离心10 min，分离血浆，采用ELISA法检测血浆中IL-6、IL-1β的水平。试剂盒购自北京热景生物技术有限公司，具体步骤严格按照操作说明进行。

3.1.5 不良事件

治疗后检查TCD、CTA或DSA了解脑血管狭窄病变情况，并由专职护理人员经过神经内科专科医生培训后对患者进行随访(对于不能来院的患者进行电话随访)，对术后3个月内出现的偏瘫、黑矇、短暂性脑缺血发作(transientischemic attack，TIA)或死亡的患者进行登记，以上均标记为不良事件。

3.2 疗效标准[16]

治疗后3个月复查，通过NIHSS评分确定疗效。

显效：临床症状好转或消失，NIHSS评分较治疗前减少≥70%。

有效：临床症状改善，NIHSS评分较治疗前减少40%～69%。

无效：未达到上述标准。

3.3 统计学方法

运用SPSS16.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验；计数资料采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3.4 治疗结果

3.4.1 两组治疗前后PBMCs中CD40 mRNA和蛋白表达的变化

分离并收集两组患者治疗前及治疗后1周的外周血PBMCs，运用Real-time PCR及Western blot对PBMCs上CD40表达进行分析，发现两组患者治疗后PBMCs中CD40 mRNA及蛋白表达均明显下降(P＜0.05，见表2、图1)，且相对于药物组，针药组PBMCs中CD40 mRNA及蛋白的表达水平下降更为显著(P＜0.05)。

表2 两组治疗前后CD40 mRNA和蛋白相对表达量的变化 (±s)

表2 两组治疗前后CD40 mRNA和蛋白相对表达量的变化 (±s)

注：与同组治疗前比较1)P＜0.05

项目 药物组 针药组治疗前 治疗后 治疗前 治疗后CD40 mRNA 2.21±0.37 1.08±0.241) 2.67±0.32 1.15±0.221)CD40 蛋白 2.16±0.18 1.06±0.181) 3.35±0.29 1.12±0.201)

图1 两组治疗前后PBMCs中CD40蛋白表达的变化

3.4.2 两组治疗前后sCD40L、IL-1β、IL-6水平比较

两组患者治疗后血浆sCD40L、IL-1β、IL-6水平均明显降低(P＜0.05)，且相对于药物组，针药组患者血浆sCD40L及IL-6的水平下降更为显著(P＜0.05)。详见表3。

表3 两组治疗前后sCD40L、lL-1β、lL-6水平比较 (±s)

表3 两组治疗前后sCD40L、lL-1β、lL-6水平比较 (±s)

注：与同组治疗前比较1)P＜0.05；与药物组比较2)P＜0.05

项目 药物组 针药组治疗前 治疗后 治疗前 治疗后sCD40L(ng/mL) 5.25±0.42 3.28±0.221) 5.88±0.64 2.15±0.161)2)IL-1β(pg/mL) 16.42±3.53 8.23±2.161) 15.78±3.44 7.89±2.641)IL-6(μg/L) 12.37±3.24 6.25±1.881) 14.56±2.58 3.65±1.271)2)

3.4.3 两组临床疗效比较

根据NIHSS评分，两组患者治疗后神经功能均得到了有效改善。药物组及针药组总有效率分别为86.0%和98.0%，针药组总有效率明显高于药物组。详见表4。

表4 两组临床疗效比较 (例)

3.5 不良事件

对两组患者进行治疗后随访，药物组不良事件总发生率为54.0%，而针药组为10.0%，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表5。

表5 两组不良事件发生率比较 (例)

4 讨论

缺血性卒中属中医学“中风”范畴[17-18]，由《难经·二十八难》及《素问·骨空论》等中医古书中的描述可知，本病的发生与心、肝、肾等重要器官的阴阳失调有关[19-21]，基于以上理论提出了针灸通督的方法来治疗缺血性卒中[22-24]，但目前这一疗法在缺血性卒中治疗中的应用仍缺乏有效的临床数据支撑及其具体作用机制的研究。本研究采用针灸通督法联合常规药物治疗，并通过神经功能缺损评分及卒中后并发症发生率等指标观察了不同治疗策略治疗缺血性卒中的疗效及预后差异。

CD40是一种分子量约为50 kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员[25]。CD40广泛表达于T淋巴细胞、B淋巴细胞、血小板、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞[26-27]。CD40的配体CD40L是一种大小约为39 kDa的跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子家族成员，机体内多种炎症刺激因子如IFN-γ、IL-1、IL-3、IL-4、TNF-α等水平异常升高会导致CD40L从活化的血小板表面脱落进入循环系统。各种细胞膜表面的CD40与CD40L结合后，CD40由细胞膜表面内化并激活，通过调节下游包括NF-κB在内的多条信号通路上调多种促炎及促凝血基因的表达[28-30]。病理状态下CD40/CD40L系统的激活通过调节炎症、免疫及凝血信号通路在多种心脑血管疾病的发生发展中发挥了重要的作用[31-33]。

因此，本研究重点考察了针灸通督法联合药物对缺血性卒中治疗疗效及预后的改善是否与CD40/CD40L系统的状态有关。研究结果显示相较于单纯药物治疗，针灸通督法联合药物治疗能显著改善缺血性卒中患者的神经功能，且能明显降低卒中患者治疗后不良事件的发生率。本研究为支持针灸治疗在临床缺血性卒中患者中的应用提供了有力的数据支撑。此外，通过检测患者外周血中的sCD40L、IL-6、IL-1β等炎症指标的变化，还发现针灸通督法联合药物治疗能够显著降低患者血浆sCD40L水平。sCD40L是机体在急性炎症反应过程中一种重要的生物标记物[34]，已有研究报道了在缺血性卒中过程中血浆sCD40L水平较对照人群显著升高，且多篇文献也证明了sCD40L可以作为多种疾病的独立危险因子在疾病的诊断及预后判断中提供指示作用[14，35]。而本研究则证实了针灸通督法联合药物治疗对sCD40L这一缺血性卒中危险因子的调控作用。

Zhang B等[11]报道了处于CD40 Kozak序列的一个功能性单核苷酸序列多态性位点rs1883832能够通过改变外周血单个核细胞CD40 mRNA的表达以及血浆sCD40L的水平影响个体缺血性卒中的发病率，表明了单个核细胞中CD40的表达在疾病过程中受到遗传及体内局部微环境的影响。本研究也观察了针灸通督联合药物治疗相对于单纯药物治疗对患者外周血单个核细胞中CD40 mRNA和蛋白表达的影响，结果显示针灸通督联合药物治疗能够使急性缺血性卒中患者单个核细胞中CD40 mRNA及蛋白的表达水平显著降低，且低于单纯药物治疗，表明针灸通督联合药物治疗能够更有效地干预患者外周血单个核细胞中CD40的表达水平。由于CD40/CD40L系统活性在机体炎症反应中的重要作用[36]，本研究还观察了体内的主要炎性指标如IL-6、IL-1β等的表达水平，针灸通督联合药物治疗后可以使患者血浆IL-6、IL-1β的水平明显下调，表明了针灸通督联合药物治疗能够通过调节CD40/CD40L系统活性降低缺血性卒中患者的急性炎症水平，从而有利于患者的恢复。本研究还观察了两组患者治疗后不良事件的发生率，其中针灸通督法联合药物治疗的患者不良事件发生率较低，进一步证明了针灸通督联合药物治疗的优势。

综上所述，针灸通督联合常规药物治疗能提高临床治疗急性缺血性卒中患者的疗效并减少治疗后不良事件的发生率，其机制可能与联合治疗方案能更有效地抑制CD40/CD40L的活性有关。但由于本次研究两组患者样本量较小，随访时间较短，所得结论及具体的机制分析仍需要在下一步的研究中进行深入探讨。