茯砖茶提取物对秀丽隐杆线虫抗氧化及寿命的影响

曾 桥，张昊亮，夏 飞，胡 歆，樊 成，段 洁，毛浓武，米柱先

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.陕西农产品加工技术研究院，陕西 西安 710021；3.咸阳泾渭茯茶有限公司，陕西 咸阳 712044；4.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710048)

0 引言

茯砖茶属于后发酵茶，主要以黑毛茶为原料，经原料筛选、渥堆、气蒸、压制成型、发花、干燥、陈化等工艺制作而成.茯砖茶加工工艺复杂，生产历史悠久，且具有内质金花普茂，开汤后汤色红浓、菌香浓郁、香气纯正、滋味醇厚的独特品质[1].研究表明，茯砖茶含有茶多酚、生物碱、氨基酸、黄酮、多糖、茶色素等多种活性成分，具有健胃消食、降血压、降血脂、抗氧化、保肝护肝、抗肿瘤、免疫调节等保健功能[2]，因而受到消费者的青睐，成为近年来茶叶市场上的热销品种.目前，对于茯砖茶的研究主要集中于茯砖茶发花工艺、冠突散囊菌分类鉴定、活性成分提取分离及纯化、保健功能及其机制研究等方面.

秀丽隐杆线虫(以下简称线虫)生命周期短，易于观察与计数，与人类具有相似的衰老过程，且遗传信息与信号通路相对保守，常被作为生物学研究的模式生物[3,4]，可以用于评价天然活性物质抗氧化活性和延缓衰老作用.因此，本实验以秀丽隐杆线虫为模型，探索了茯砖茶提取物对线虫急性氧化应激、寿命、抗氧化酶活力以及抗氧化基因表达水平的影响，以研究茯砖茶的抗氧化和延长寿命作用及其机制，从而为茯砖茶的科学饮用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茯砖茶，以湖南安化天尖黑茶为原料，由陕西朴道茯茶股份有限公司加工制成茯砖茶.

野生型线虫N2和大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)OP50，由陕西科技大学药学系提供.

超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所.

30%双氧水、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、胆固醇、无水乙醇、氢氧化钠、胰蛋白胨、琼脂粉、酵母抽提物、0.9%生理盐水，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司.

NGM培养基、M9缓冲液 ，按照参考文献[5]稍作修改配制而成.

1.2 仪器与设备

Varioskan flash酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；FA1004N电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；GH-420ASB隔水式恒温培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 茯砖茶制备

取茯砖茶1块(500 g)，掰开揉碎，混合均匀，称取1 g，置于50 mL沸水中冲泡5 min后立即过滤，收集滤液并灭菌，待冷却后用无菌水定容至50 mL，得浓度为20 mg/mL茯砖茶提取物母液.精密吸取茯砖茶提取物母液用无菌水配制成质量浓度为200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯砖茶提取物工作液，喂食前经0.22μm微孔膜过滤.

1.3.2 线虫同期化培养

挑取20条处于产卵期的线虫至涂E.coliOP50的NGM培养基平板上，于20 ℃生化培养箱中培养2 h，取出平板，挑走线虫，继续将平板置于20 ℃生化培养箱中培养3 d，即得同期化线虫.

1.3.3 氧化应激实验

挑取同期化线虫20±2条转移到分别喂食含不同质量浓度茯砖茶提取物100μL的NGM培养基中，其中每10 mL NGM培养基添加浓度30%的双氧水10μL，每20 min挑出死亡线虫并计数，直至线虫全部死亡.每组实验3板，同时做空白，绘制线虫存活时间曲线.

1.3.4 线虫寿命测定

挑取同期化线虫20±2条转移到分别喂食质量浓度为0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯砖茶提取物100μL的NGM培养基中，置于20 ℃生化培养箱中培养，每1 d观察平板上线虫生长情况，记录死亡线虫数量，并将死亡线虫挑出.每2 d更换新鲜培养基，直至所有线虫死亡，每组实验3板，计算线虫平均寿命，并绘制寿命曲线.

1.3.5 线虫体内抗氧化酶活力测定

将同期化线虫分别于含不同质量浓度茯砖茶提取物100μL的NGM培养基中培养5 d后，收集至EP管.加入1 mL磷酸盐缓冲液(pH6.0)于3 000 r/min离心1 min，弃上清.进一步加入灭菌后的生理盐水洗涤，离心弃上清，重复3次.将经生理盐水洗涤后的线虫置于研钵中，加入液氮至液面没过样品，待液氮挥发后，在研钵内研磨样品约2 min，待样品融化后，继续加入液氮，如此反复冻融3次，离心取上清液，按试剂盒说明书要求测定SOD、CAT活力，实验重复3次.

1.3.6 抗氧化基因表达水平测定

收集同期化线虫，将同期化线虫分别在空白培养基及400μg/mL茯砖茶提取物的NGM培养基中培养5 d后，用M9缓冲液将线虫冲洗至EP管中，3 000 r/min离心1 min，弃上清.加灭菌生理盐水，离心弃上清，重复洗涤3次，含线虫悬液的EP管放入-80 ℃冰箱备用，并送往上海生工依次进行线虫RNA的提取、RNA纯度及完整性的鉴定，合成cDNA，采用实时荧光定量PCR监测线虫体内相关抗氧化基因mRNA表达水平，以gpd-1为持家基因，分别监测age-1,sir-2.1,sod-3,daf-16,ctl-1mRNA表达.mRNA表达水平测定用PCR引物见表1所示.

表1 秀丽隐杆线虫抗氧化基因mRNA表达水平测定用PCR引物[6]

1.4 数据处理

2 结果与讨论

2.1 茯砖茶提取物对H2O2损伤组线虫的保护作用

研究表明，双氧水在线虫体内的氧化还原反应会诱导产生细胞内的氧化应激[7].由图1可以发现，相对于空白组，200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯砖茶提取物组线虫平均存活率分别提高了19.65%、23.12%、11.56%、4.62%、1.73%，说明茯砖茶提取物对H2O2损伤组线虫具有一定保护作用.

茯砖茶提取物中含有茶多酚、黄酮、多糖等抗氧化活性成分，一方面抗氧化活性成分对线虫体内与自由基的生成有关的酶如髓过氧化酶(MPO)、脂氧化酶和环氧酶等有抑制作用，另一方面抗氧化成分能够防护体内抗氧化酶和增强体内抗氧化酶活性，从而起到抗氧化作用，因此提高了线虫氧化应激能力[8].

从图1还可以看出，茯砖茶提取物组对提高线虫氧化应激能力随浓度的增加先上升后下降，饲喂400μg/mL茯砖茶提取物组效果最佳，这可能是由于茶叶中还含有咖啡因等[9]，提取物浓度过高对线虫有一定毒害作用.

图1 茯砖茶提取物对双氧水损伤组线虫的保护

2.2 茯砖茶提取物对线虫寿命的影响

有研究表明，抗氧化被认为是实现抗衰老的重要方法，吕振宇等[10]研究发现枸杞可以降低线粒体中O2-·的水平，主要在线粒体中发挥抗氧化作用.从图2可以看出，与空白组相比，200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯砖茶提取物组平均寿命分别延长14.05%、19.82%、7.69%、5.33%、2.66%，说明一定质量浓度的茯砖茶提取物能够有效的延缓线虫的衰老.实验结果还发现，400μg/mL茯砖茶提取物组线虫最高寿命可达22 d，而空白组线虫最高寿命分别为18 d，最高寿命延长了22.2%，这和氧化应激实验结果一致.

图2 茯砖茶提取物对线虫寿命影响

2.3 茯砖茶提取物对线虫体内主要抗氧化酶活力的影响

SOD是有效清除生物体内活性氧的主要酶类之一，是抗氧化系统的第一道防线[11]，CAT也是清除生物细胞中活性氧的重要保护酶类，通过催化细胞代谢过程中产生的过氧化氢，从而防止氧自由基的形成，因此，适当增加生物体内SOD和CAT含量有助于抗氧化和延长寿命.

从图3可以看出，相对于空白组，饲喂200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯砖茶提取物线虫体内SOD酶活分别提高15.61%、23.31%、12.82%、4.87%和1.42% .从图4可以看出，相对于空白组，饲喂200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯砖茶提取物线虫体内CAT酶活分别提高24.71%、38.29%、14.27%、5.26% 和4.12%.说明饲喂茯砖茶提取物可提高线虫体内SOD及CAT酶活力，且提高SOD及CAT酶活的能力随浓度的增加先上升后下降，这和氧化应激以及寿命实验研究结果相吻合.

图3 茯砖茶提取物对线虫体内SOD活力的影响

图4 茯砖茶提取物对线虫体内CAT酶活力的影响

2.4 茯砖茶提取物对线虫抗氧化基因表达水平的影响

图5反映了茯砖茶提取物对线虫抗氧化基因表达水平的影响.从图5可以看出，相对于空白组，经茯砖茶提取物处理的线虫体内ctl-1、daf-16、sir-2.1和sod-3mRNA相对表达量均有不同程度的提高，而age-1mRNA表达水平呈下降趋势.ctl-1、daf-16、sir-2.1和sod-3mRNA相对表达量分别提高44.5%、13.7%、22.5%和42.9%；age-1mRNA相对表达量下降5.4%.在秀丽隐杆线虫中，许多基因发挥延长寿命的作用与daf-16转录因子的作用密切相关[12]，且已被daf-16缺陷型线虫寿命实验证实[13].age-1是最早发现的与线虫寿命有关的基因，是胰岛素/类胰岛素信号通路中抑制daf-16活性的关键因子，age-1mRNA表达水平的下降可降低对daf-16活性的抑制，而sir-2.1作为一种长寿基因，可以通过脱乙酰化直接激活daf-16[6]，daf-16激活可以促进sod-3及ctl-1的激活，从而延长线虫寿命，这与本实验的结果一致.

图5 茯砖茶提取物对线虫相关基因相对表达影响

3 结论

本实验采用线虫这一模式生物，以整体动物抗氧化和寿命实验作为检测手段，研究茯砖茶提取物对线虫抗氧化和寿命的影响.结果表明，饲喂茯砖茶提取物提高了线虫体内SOD及CAT酶活力，增强了线虫氧化应激能力，延长了线虫寿命.抗氧化基因表达水平测定结果表明，饲喂茯砖茶提取物组可不同程度的提高线虫体内ctl-1、daf-16、sir-2.1和sod-3mRNA的表达水平，同时降低age-1mRNA表达水平，因而使得线虫寿命得到延长.因此，饲喂茯砖茶提取物提高线虫氧化应激能力及寿命的机制可能在于茯砖茶提取物增强了线虫体内抗氧化酶活性同时调节抗氧化基因表达水平，这为科学饮用茯砖茶提供了参考.