WISP2在非小细胞肺癌中的表达情况及对肺癌A549细胞周期分布和凋亡情况的影响

董兵，刘晓隗，王苏，陈秀军

解放军第三〇五医院心胸外科，北京100017

近年来，肺癌的发病率逐步升高，严重威胁人类的身体健康，是临床常见的恶性肿瘤[1]。相关研究显示，吸烟、职业、环境、电流辐射、遗传等因素均可引起非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]，早期临床症状包括胸部胀痛、痰血等，晚期可出现疲乏、体重减轻、食欲下降和呼吸困难等[3]。研究发现，肿瘤组织中异常表达的WNT1诱导信号通路蛋白2（WNT1 inducible signaling pathway protein 2，WISP2）可能与肿瘤的发生、发展密切相关[4]，但WISP2蛋白的具体作用机制尚未明确且其与生物学特征关系的报道较少。相关数据显示，WISP2基因具有多功能调节的作用，是肿瘤细胞增殖的负性调节因子，WISP2的缺失可能是导致肿瘤细胞增长失控的原因[5-7]，因此，WISP2成为近年来临床的主要研究热点[6]。本研究主要探讨WISP2在NSCLC中的表达情况及对肺癌A549细胞生物学行为的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2019年3月解放军第三〇五医院收治的NSCLC患者。纳入标准：①均经病理学确诊为NSCLC；②生存时间＞3个月；③临床分期为Ⅰ～Ⅲ期；④临床资料完整。排除标准：术前未接受放化疗及其他抗肿瘤治疗；合并其他系统继发性恶性肿瘤。依据纳入和排除标准，本研究共纳入60例NSCLC患者，其中男37例，女23例；年龄44～75岁，平均年龄为（55.38±6.77）岁，＜60岁21例，≥60岁39例；病理类型：鳞状细胞癌35例，腺癌21例，其他4例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ期36例；分化程度：低分化31例，中分化26例，高分化3例；吸烟35例，不吸烟25例；淋巴结转移38例，无淋巴结转移22例。同时取60例NSCLC患者的NSCLC组织和相应的癌旁正常组织。

1.2 免疫组化法检测WISP 2蛋白的阳性表达情况

取NSCLC组织和相应的癌旁正常组织制成4 μm的切片，脱蜡、水化、修复等。采用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法检测WISP2蛋白的阳性表达情况，具体步骤按照说明书进行。抗原修复后，滴加山羊非免疫血清工作液封闭，加入一抗，3℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗后，加入二抗，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染。SP免疫组化法检测NSCLC组织和癌旁正常组织中WISP2的表达情况。在光镜下观察WISP2蛋白的染色情况，选取PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性表达的石蜡切片作为阳性对照。

1.3 细胞实验方法

1.3.1 细胞、主要试剂及仪器顺铂耐药的肺癌A549细胞株购自美国BD公司。膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）试剂盒购自美国Sigma公司，巴比妥钠孵育缓冲液购自美国ABI公司，RPMI 1640培养基购自美国Corning公司，恒温培养箱购自德国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3.2 细胞转染和分组取肺癌A549细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。取对数生长期的肺癌A549细胞接种于6孔板，每孔1×105/ml。待细胞贴壁，按照试剂盒说明书将WISP2蛋白过表达的载体转染至肺癌A549细胞，作为观察组，未转染的肺癌A549细胞作为对照组。

1.3.3 流式细胞仪检测细胞周期分布情况取NSCLC组和对照组肺癌A549细胞，胰蛋白酶消化后，乙醇洗涤，1000 r/min离心15 min后，300 μl胎牛血清重悬细胞，加入预冷的70%乙醇5 ml，4℃固定过夜，收集细胞，加入PI染色液500 μl，4℃避光孵育30 min后，过300目筛网，采用200 μl的胎牛血清再次重悬细胞，流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况采用Annexin V-FITC/PI双染法，将NSCLC组和对照组肺癌A549细胞转移至离心管，胰蛋白酶消化后，1000 r/min，离心5 min，除去上清液。加入1 ml预冷的胎牛血清重悬细胞，加入1 ml预冷的巴比妥钠孵育缓冲液和5 μl的Annexin V-FITC混匀，室温避光孵育10 min，再加入10 μl的PI染色液，4℃避光孵育30 min后，过300目筛网，采用200 μl孵育缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对所有数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；等级资料的比较采用Mann-WhitneyU检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WISP 2蛋白表达情况的比较

NSCLC组织中WISP2蛋白的阳性表达率为51.67%（31/60），低于癌旁正常组织的70.00%（42/60），差异有统计学意义（χ2=4.232，P＜0.05）。

2.2 不同临床特征NSCLC患者NSCLC组织中WISP 2蛋白表达情况

不同年龄、性别NSCLC患者NSCLC组织中WISP2蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同吸烟情况、病理类型、临床分期、分化程度、淋巴结转移情况NSCLC患者NSCLC组织中WISP2蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

2.3 细胞周期分布情况的比较

观察组肺癌A549细胞G1期细胞比例明显高于对照组细胞，S期和G2期细胞比例均明显低于对照组细胞，差异均有统计意义（P＜0.01）。（表2）

2.4 细胞凋亡情况的比较

观察组肺癌A549细胞的凋亡率为（5.55±0.69）%，明显高于对照组细胞的（3.05±0.43）%，差异有统计意义（t=19.026，P＜0.01）。

表1 不同临床特征NSCLC患者NSCLC组织中WISP 2蛋白表达情况（n=60）

表2 两组肺癌 A549细胞周期分布情况的比较（±s）

表2 两组肺癌 A549细胞周期分布情况的比较（±s）

组别G1期S期G2期观察组对照组t值P值60.12±7.15 40.99±5.28 13.158 0.000 25.72±3.88 37.32±4.55 11.447 0.000 14.15±1.94 21.69±3.81 10.083 0.000

3 讨论

相关研究显示，恶性肿瘤的发展过程由多种因素、多个步骤共同作用，正常细胞在与外界接触或自身因素的刺激下，逐渐恶性增殖、分化，最终进展为恶性肿瘤细胞[8-10]。肿瘤细胞与肿瘤基质成分可共同参与肿瘤细胞的浸润和转移过程，在此过程中，细胞表面黏附分子的改变也发挥了重要作用，与肿瘤细胞的生物学行为密切相关[10-11]。表明肿瘤细胞的形成过程较为复杂，其特异性生物学行为随肿瘤类型的不同而产生变化[12]。相关研究显示，NSCLC早期症状不明显，多数患者就诊时已处于晚期，失去了最佳的手术时机，导致肺癌患者的生存率较低、病死率较高[13-14]。因此，早期诊断NSCLC，研究其发病机制，并对其肿瘤细胞的生物学行为进行探讨，对提高NSCLC患者的生存率具有重要临床意义。相关研究显示，WISP2蛋白可抑制肺癌A549细胞的增殖[15]，具有一定临床价值，本研究主要探讨WISP2在NSCLC中的表达情况及对肺癌细胞生物学行为的影响，现报道如下。

研究显示，WISP2是一种抑癌基因，可编码多种细胞外基质蛋白，调控细胞增殖、分化和凋亡过程，对骨骼、神经及血管的发育具有抑制作用[16-18]。WISP2含有28个半胱氨基酸，可参与多种重要的生物学过程。研究显示，WISP2在NSCLC的发生发展中发挥重要作用，WISP2可作为临床治疗NSCLC的重要靶蛋白[19]。临床探讨WISP2在NSCLC中的表达情况及相应的生物学行为对NSCLC的早期诊断、治疗和预防提供了理论依据[20-21]。

本研究结果显示，NSCLC组织中WISP2蛋白的阳性表达率为51.67%，低于癌旁正常组织的70.00%，差异有统计学意义（P＜0.05）。推测WISP2蛋白的表达情况与NSCLC的发生发展可能有关。本研究结果显示，不同吸烟情况、病理类型、临床分期、分化程度、淋巴结转移情况NSCLC患者NSCLC组织中WISP2蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；观察组肺癌A549细胞G1期细胞比例明显高于对照组细胞，S期和G2期细胞比例均明显低于对照组细胞，观察组细胞的凋亡率也明显高于对照组细胞。表明WISP2可对肿瘤细胞的周期分布和凋亡进行调控，有助于NSCLC的早期诊断并对其恶性程度进行评估，为NSCLC的治疗提供参考。

综上所述，WISP2在NSCLC组织中表达水平较低，其在NSCLC的发生发展过程中发挥重要作用。