中国美利奴羊（新疆型）GPR143基因一个新的SNP突变及其遗传效应分析

买尔哈巴·艾合麦提 ，田月珍 ，柏 妍 ，杨雪梅 ，田可川 *，黄锡霞 *

（1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆阿克苏地区畜牧技术推广中心，新疆 阿克苏 843000；3.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830000）

巨大的国内市场需求为中国细毛羊产业的发展创造了机遇，同时也形成了挑战，传统的育种方法已经不能完全满足羊毛生产与市场需求，因此，分子育种在细毛羊的选种选育过程中尤为重要。中国美利奴羊（新疆型）是在1984年由澳洲美利奴公羊与新疆细毛羊杂交培育而成的毛用细毛羊品种[1-2]，在该品种审定之后，就继续开展有计划、有规模的选种选育工作。该品种羊的肌肉发达、体质健硕、适宜放牧，并且具有毛长且弯曲、毛丛结构好、呈油白色和乳白色、净毛量高和含量均匀适中等特点。艾买提·买买提[3]和玛依拉·吐尔逊[4]采用PCR-SSCP技术对中国美利奴羊（新疆型）群体中的KAP基因和KRT基因分别进行了多态性检测以及关联性分析了这两个基因与羊毛性状的关系；冯静等[5-7]通过采用克隆测序法和PCR-SSCP技术对KAP1.1、KAP1.3及KAP6.1基因的多态性及其与羊毛性状的关系在中国美利奴羊 （军垦型）群体中进行了研究；许汉峰[8]对中国美利奴羊（军垦型）群体中角蛋白关联蛋白基因（KAP及KRT基因）与绵羊毛品质的相关性进行了研究分析。这些研究都为影响中国美利奴羊（新疆型）的羊毛性状候选基因的研究分析提供了方法和理论依据。GPR143基因也被称为OA1蛋白，作为G偶联蛋白受体家族的成员之一[9-10]，编码包含404个氨基酸残基组成的蛋白质，这种蛋白质是一种黑素小体膜整合性蛋白，重点是在视网膜的色素上皮层、皮肤的黑色素细胞以及虹膜中表达，在眼睛、皮肤以及毛发中的色素蛋白质的形成中起重要作用[11]，并发挥着转导信号的作用，其功能是调节黑色素小体的生长[12]。本研究目的是通过分析中国美利奴羊（新疆型）群体内的GPRl43基因的遗传特征来寻找多态性，并对GPRl43基因的多态性与羊毛重要经济性状进行关联性分析，以期发现GPRl43基因对羊毛毛品质性状的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本试验数据由新疆伊犁新源县巩乃斯种羊场提供，试验动物为新疆巩乃斯种羊场所供应的中国美利奴羊（新疆型）周岁羊，共采集550只中国美利奴羊（新疆型）的毛样及血样，其中，周岁羊418只，两周岁羊132只。

1.2 实验方法

1.2.1 数据收集和整理

收集巩乃斯种羊场2011-2012年418只的周岁羊与2010-2012年132只的两周岁羊羊毛品质鉴定记录，用EXCEL软件进行初步整理。

1.2.2 引物设计

根据NCBI提供的绵羊GPR143基因序列 （Gene Bank登录号NC-019484），采用引物设计软件Primer Premier 5.0进行引物设计，并送至上海Sangon Biotech公司合成。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3 PCR扩增及产物检测

PCR扩增反应体系的模板是提取的基因组DNA，总体积是20 μL，反应体系见表2。通过梯度PCR寻求样品的最佳退火温度，PCR的扩增程序见表3，将扩增产物放置于2%琼脂糖凝胶并在100 V的条件下电泳检测20 min。

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应程序

1.2.4 PCR-SSCP凝胶电泳

取10 μL PCR扩增产物与8 μL变性缓冲液，将其离心混匀，98℃变性10 min，之后立刻冰浴20min。将变性后的PCR扩增产物全部上样于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，在300 V的电压下预电泳30 min，随后180 V恒压电泳16 h。在聚丙烯酰胺凝胶电泳结束之后，采用银染色法对凝胶进行染色，并通过显色情况判定其基因型。

1.3 数据统计与分析

运用统计软件计算基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数、纯合度及杂合度及多态信息含量（PIC），并用Hardy-Weinberg平衡检验品种内基因型的分布。用SAS8.1软件对GPR143基因的不同基因型和中国美利奴羊（新疆型）羊毛性状进行关联分析。分析模型如下：

其中，Yijk=分析性状的观测值；μ=总体均值；ai=基因型效应；bj=群别效应；qk=年龄效应；eijk=随机误差。

(2)多元化合作：①鼓励“师傅型”教师与企业师傅合作交流，以结对子、拜师傅等形式交流传承技能经验，提高自身的职业能力；②参与校企合作召开的专业座谈会、课程建设讨论会、技能比赛等活动，提升师资的企业文化理念与职业教育理念。

2 结果

2.1 DNA完整性检测结果

用0.8%琼脂糖进行凝胶电泳检测DNA模板。如图1所示，DNA纯度高、质量良好，可直接作为模板DNA使用。

图1 DNA检测结果电泳图

2.2 GPR143基因的PCR检测和PCR-SSCP多态性检测结果

由图2可知，用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，发现GPR143基因的PCR产物大小为287 bp。结果显示，扩增获得的片段长度与预期的大小一致，并且未形成引物二聚体，可以在后续试验的多态性检测中运用。

对GPR143基因的PCR扩增产物进行PCR-SSCP分析，由图3可知，GPR143基因的扩增片段在中国美利奴羊（新疆型）群体中存在三种不同的基因型，分别命名为 AA，AB，BB 型。泳道 1、2、4、5、6、7、8、9、11为AA基因型；泳道3和12为BB基因型；泳道10为AB基因型。

图2 PCR扩增结果电泳图

图3 PCR-SSCP电泳图

2.3 多序列对比

由图4可知，对PCR扩增产物进行DNA双向测序，将测序结果与已知的绵羊GPR143基因的CDs序列进行比对，在外显子6上得到AA、BB和AB三种基因型。在217 bp处AA基发生碱基突变，即G→T；在229 bp处AB基因型发生碱基突变，即C→T。

图4 不同基因型个体多序列对比图

2.4 GPR143基因外显子6基因频率和基因型频率分析

由表4可知，GPR143基因外显子6的三种基因型AA、AB和BB的基因型频率分别为0.76、0.16和0.08。其中A等位基因频率为0.84，B等位基因频率为0.16。经过χ2检验发现，该位点在中国美利奴羊（新疆型）群体中处在Hardy-Weinberg不平衡状态(P＜0.05)。根据确定位点多态性的标准，GPR143基因的外显子6的多态信息含量为0.23，属于低度多态位点。

表4 GPR143基因外显子6的基因型分布频率及遗传特性

2.5 GPR143基因与羊毛性状的关联性分析

使用SAS8.1软件分析基因型、群别及年龄对羊毛性状的影响。如表5所示，基因型对剪毛量、平均直径、毛纤维直径变异系数、油汗、毛弯曲数、鉴定时体重、剪毛后体重、体格大小、毛长度评分、毛弯曲评分、毛细度评分的影响不显著（＞0.05）；而对光泽有显著的影响（＜0.05）。群别对剪毛量、毛纤维直径变异系数、油汗、鉴定时体重、剪毛后体重、光泽、毛长度评分、毛细度评分有极显著影响(＜0.01)；而对平均直径、毛弯曲数、体格大小、毛弯曲评分的影响不显著（＞0.05）。年龄对剪毛量、平均直径、油汗、剪毛后体重、光泽、毛弯曲评分有极显著影响(＜0.01)；对鉴定时体重有显著的影响（＜0.05）；而对毛纤维直径变异系数、毛弯曲数、体格大小、毛长度评分、毛细度评分影响不显著（＞0.05）。

2.6 不同基因型与毛性状之间的最小二乘均数、标准误及多重比较

表6 不同基因型与羊毛性状之间最小二乘均数和标准误及多重比较

3 讨论

在NCBI数据库中可以查到，GPR143基因位于绵羊的X染色体上，全基因组序列长度为40022 bp，由10个外显子和8个内含子组成。最常见的眼白化病类型是眼部白化病I型（OA1），是由GPR143基因突变导致的，其产物OA1蛋白是一种G蛋白受体，在细胞与细胞间的信号传导和物质运输中起重要作用。GPR143基因提供了制造涉及眼睛和皮肤的着色（色素沉着）的蛋白质。 这种蛋白质在视网膜和皮肤细胞的光敏组织中形成的。GPR143蛋白是控制黑素体生长和成熟的信号传导途径的一部分，黑素体是产生和储存称为黑色素的色素的细胞结构。 黑色素是给皮肤，毛发和眼睛填充颜色的物质。在视网膜中，这种色素在正常视力中也起着关键的作用。GPR143基因也可导致严重的视力障碍，例如眼球震颤、畏光、斜视、视力低下、色素沉着不均匀等。Schiaffino等[13]用免疫荧光学技术将内源性OA1蛋白定位在黑素细胞中的黑素小体膜上。在后来的研究过程中发现OA1蛋白在非黑素细胞中被定位在溶酶体膜上。金怡轩和刘斐等[14]研究了一例OA1型家族的致病基因GPR143，并对该基因进行突变检测，发现该基因GPR143出现了新的突变。通过PCR扩增OA1型致病基因GPR143的外显子以及邻近的内含子，并进行直接测序，结果显示，在OA1型的患者的致病基因GPR143中发现了整个外显子的缺失突变，从而扩展了OA1型致病基因的突变频谱。

周琦等[15]的研究表明：OA1型致病基因GPR143的产物是OA1蛋白，它是在视网膜色素的上皮细胞中表达产生的。大多数的突变改变的是GPR143蛋白质的大小或形状。这些基因变化经常阻碍异常蛋白质到达黑素体，这些黑素体需要控制这些含色素结构的生长。GPR143蛋白通常到达黑素体，但突变阻止蛋白质与其信号通路中的其他分子相互作用。 没有功能性的GPR143蛋白质，皮肤细胞和视网膜中的黑色素体就会异常增大。 目前尚不清楚这些巨大黑素体（macromelanosomes）与眼部白化病患者的视力丧失和其他眼部异常有关。

Masukawa D等[16]的研究表明，OA1-免疫反应分布在大鼠中枢神经系统神经元或细胞，使用SDOCT技术来确定眼白化病患者GPR143基因的突变频率，应用PCR扩增的完整编码序列进行突变筛查和确定GPR143基因的序列并分析揭示了两个病人病理基因突变[17]。

目前，GPR143基因对中国美利奴（新疆型）相关性状调控的研究分析尚未见报道，但通过它的生物学功能，我们可以推测出该基因可能对羊毛的毛品质性状有影响。本试验选取同一品种中国美利奴（新疆型）不同年龄（周岁，两岁），经过PCR-SSCP技术，在GPR143基因外显子6上发现碱基突变，产生三种带型：AA，AB和BB基因型。BB基因型的光泽显著高于AA和AB型。在217 bp处AA基发生碱基突变，即G→T；在229 bp处AB基因型发生碱基突变，即C→T。

4 结论

采用PCR-SSCP技术对绵羊GPR143基因外显子6区域的单核苷酸多态性进行了分析，将测序结果与已知的绵羊GPR143的CDs序列进行比对，在外显子6上得到三种基因型，首次在外显子6发现碱基突变。该位点属于低度多态位点并且该位点的突变可能是影响羊毛光泽的重要位点。本研究设计的引物片段较少，扩增针对的外显子不全面，所以有待扩大样本量，延伸基因区域范围进行更深入的研究，从而更全面的确定GPR143基因的功能。