应用HPLC法对5种花色铃儿花花青素的定量分析

王志广 张盟雨 易礼江

摘要    利用高效液相色谱法（HPLC）分析不同花色铃儿花中花青素组分及其含量。样品经处理后，分析柱为C18柱、流动相为4%磷酸水溶液与乙腈、等梯度洗脱、检测波长520 nm、外标法定量进行分析。结果表明，在玉色、白色、浅粉色、粉色、红色5个典型花色中，浅粉色铃儿花的花青素种类最多，为24种。随着铃儿花颜色的加深，花青素总含量逐渐增加，红色铃儿花花青素含量最高，达411.19 μg/g。不同花色的铃儿花中，HPLC峰面积与峰高比值与芍药素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草色素和锦葵色素含量成正相关趋势。

关键词    花青素;铃儿花;高效液相色谱法

中图分类号    S685.21        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）14-0130-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    The anthocyanin constituents and contents in Enkianthus quinqeuflorus Lour with different colors were analyzed by high performance liquid chromatography（HPLC）.After treating the samples ，the analytical column was C18，with 4% phosphoric acid aqueous solution and acetonitrile as the mobile phase，the isometric elution，520 nm of detection wavelength，and the external standard method were used for quantification.The results showed that in the jade，white，light pink，pink and red of E. quinqeuflorus Lour，the number of anthocyanin components of light pink was the highest，reaching 24.With the deepening of the color of E .quinqeuflorus Lour，the total anthocyanin content increased gradually，the highest content of which was red flower，reaching 411.19 μg/g.The ratio of peak area to height in HPLC was positively correlated with the contents of peonidin-3-O-glucoside，delphinidin chloride and malvidin chloride.

Key words    anthocyanin;Enkianthus quinqeuflorus Lour;high performance liquid chromatography

铃儿花（Enkianthus quinqeuflorus Lour.），属于杜鹃花科吊钟花属落叶或半常绿灌木（或小乔木），其野生群落可使满山红遍，深红与粉红相间，其叶色秋季呈鲜艳的黄褐色至红色，以绚丽多彩的大色块表现群体的色彩美[1]。花青素，又名花色素，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，具有抗氧化性、清除自由基、抗肿瘤、减轻肝机能障碍等生理功能[2]。目前，已知的花青素有23种[3]，主要有天竺葵色素、矢車菊色素、飞燕草色素、芍药色素、矮牵牛色素、锦葵色素[4]等。其中，天竺葵色素呈砖红色，矢车菊色素和芍药色素表现为紫红色，飞燕草色素、矮牵牛色素与锦葵色素为蓝紫色[5-6]。

目前，国内外对于铃儿花花青素的研究尚未见报道，本研究通过超声法快速提取铃儿花花青素，建立铃儿花花青素组分的高效液相色谱定量分析方法，同时比较了不同花色铃儿花中花青素含量，以期为铃儿花色素的深入研究奠定基础。

1    材料与方法

1.1    材料与试剂

铃儿花样品，采集于广东省沙头角林场。芍药素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草色素、锦葵色素、矮牵牛色素等4种花青素标准品，购自上海源叶生物科技有限公司;磷酸、甲醇和盐酸均为分析纯，分别购于天津市富宇精细化工有限公司、天津四友精细化学品有限公司和珠海市华成达化工有限公司;乙腈为色谱纯，购于北京迈瑞达科技有限公司。

1.2    仪器与设备

LC30 AD双泵高效液相色谱仪和SPD-20A UV/VIS检测器，SHIMADZU公司生产;反相InertSustain C18柱（4.6 mm×250 mm），岛津技迩（上海）高贸有限公司生产;SB-5200 DTN超声波清洗器，宁波新芝生物科技有限公司生产;AR 423CN电子天平，奥豪斯公司生产;ADW-2002-M超纯水系统，艾科浦公司生产。

1.3    试验方法

1.3.1    材料采集。2019年2月下旬，当日为阴天有雾、空气湿度95%以上、气温22℃，选择玉色、白色、浅粉色、粉色和红色铃儿花，采集带花枝条，在保湿状态下快速带回实验室，擦干花序表面水分。收集花序于75 ℃烘干至恒重，研磨过60目筛，置于干燥器内备用。当天测定铃儿花水分含量。

1.3.2    花青素提取。准确称取0.5 g样品，并溶于10 mL 1%盐酸甲醇（V∶V）中，充分混匀;将浸泡液避光置于超声波处理30 min;使用0.45 μm滤膜过滤浸泡液，将滤液置于4 ℃冰箱中保存，残渣再使用10 mL 1%鹽酸甲醇浸泡，重复上述操作2次后，将30 mL提取液合并于棕色瓶中，置于-80 ℃冰箱保存备用。取适量提取液用1%盐酸甲醇稀释一定浓度后取10 μL上样。

1.3.3    花青素测定。采用外标法定量分析花青素，用高效液相色谱仪测定。绘制标准曲线：精确称取各标准品适量溶于1%盐酸甲醇溶液中，配制成1.00 mg/mL的标准储备液。分别取标准储备液0.01、0.05、0.10、0.20、1.00 mL定容至1 mL的1%盐酸甲醇溶液中，配制成浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.20、1.00 mg/mL的系列标准溶液，将标准溶液用0.22 μm滤膜过滤，进样10 μL。以标准品浓度为纵坐标，峰面积为横坐标进行线性回归分析，绘制标准曲线。

1.3.4    色谱分析。色谱柱为C18柱，流动相为4%磷酸∶乙腈（体积比为88∶12，pH值2.0），流速为0.8 mL/min，0.45 μm滤膜抽滤，等梯度洗脱，柱温35 ℃，检测波长520 nm，灵敏度1.0 AUFS，进样量10 μL。

1.3.5    提取液中花青素含量的计算。花青素含量计算公式为x（%）=■×f×100。式中，x为花青素含量;A为样品中花青素峰面积;C为标准溶液中花青素的浓度（mg/mL）;V为样品最终定容体积（mL）;AS为标准溶液中花青素峰面积;m为试样质量（g）;f为稀释倍数。铃儿花花序中总花青素含量为芍药素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草色素、锦葵色素、矮牵牛色素4种花青素之和。

1.4    数据分析

采用Microsoft Excel 2007软件对数据进行整理，采用峰面积归一化法计算花青素含量，以鲜质量计。

2    结果与分析

2.1    不同花色铃儿花花青素种类比较

本试验在广东梧桐山国家森林公园采集玉色、白色、浅粉色、粉色和红色5种不同花色铃儿花（图1），经HPLC分析，测得花青素色谱峰有8～24种。其中，玉色和白色铃儿花样品中花青素种类最少，分别只有8种和9种;浅粉色铃儿花花青素种类最多，达24种（图2）。结果表明，浅粉色铃儿花花青素种类最丰富。

2.2    不同花色铃儿花花青素含量比较

采用高效液相色谱法分别对不同花色的铃儿花序中芍药素-3-O-葡萄糖苷（PG）、飞燕草色素（DC）、锦葵色素（MC）和矮牵牛色素（PC）进行定量分析。结果显示，在5种铃儿花中均未检测出PC成分。

PG、DC和MC在不同花色铃儿花中含量均不相同。由图3可知，PG和DC含量随铃儿花颜色加深，呈先上升后下降的趋势。PG含量在浅粉色铃儿花中最高，达267.78 μg/g，此时HPLC色谱峰面积与峰高比值（A/H）为11.08;DC在粉色铃儿花中含量最高，为5.57 μg/g，A/H为5.78。MC在玉色、白色和浅粉色铃儿花中未检出，在红色铃儿花中含量最高，达405.89 μg/g，此时A/H为11.03。PG、DC和MC等3种花青素在HPLC中A/H的变化趋势均与含量成正比，因而可直接采用A/H进行花青素定性分析。随着铃儿花颜色逐渐加深，3种花青素总含量也逐渐增加，玉色铃儿花花青素总含量最少，为213.60 μg/g;红色铃儿花花青素总含量最高，达411.19 μg/g。

3    结论

铃儿花含有花青素资源，在开发天然色素、保健食品和天然抗氧化剂等方面具有潜在的开发应用前景。本文采集的玉色、白色、浅粉色、粉色、红色5种典型花色中测得花青素 8～24种，其中浅粉色铃儿花样品中花青素种类最多（24种），其颜色表型也最丰富。红色铃儿花样品颜色最深，检测获得的芍药素-3-O-葡萄糖苷（PG）、飞燕草色素（DC）和锦葵色素（MC）3种花青素总含量最高（411.19 μg/g）。峰面积与峰高比值（A/H）可反应MC、PG和DC的变化趋势。

4    参考文献

[1] 和太平.优良观花灌木铃儿花[J].中国花卉盆景，2005（7）：27.

[2] TRUONG V，DEIGHTON N，THOMPSON R T，et al.Characterization of anthocyanins and anthocyanidins in purple-fleshed sweet potatoes by HPLC-DAD/ESI-MS/MS[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（2）：404-410.

[3] 吕海鹏，费旭元，梁名志，等.茶树特意品种“紫鹃”中的花青素组分分析[J].食品科学，2012，33（22）：203-206.

[4] 刘超，王征，李鑫，等.高效液相色谱法分析不同品种紫甘薯中花青素组分及其含量[J].中国食物与营养，2008（8）：19-21.

[5] KONG J M，CHIA L S，GOH N K，et al.Analysis and biological activities of anthocyanins[J].Phytochemistry，2003，64（5）：263-268.

[6] 殷丽琴，彭云强，钟成，等.高效液相色谱法测定8个彩色马铃薯品种中花青素种类和含量[J].食品科学，2015，36（18）：143-147.