病证结合模式下骨质疏松症实验动物模型的研究进展

孙凯 魏戌* 朱立国* 戴建业 章轶立 谢雁鸣

1.中国中医科学院望京医院，北京 100102 2.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730020 3.北京中医药大学，北京 100029 4.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700

西医辨病和中医辨证相结合的现代病证结合模式，是当前中医药及中西医结合工作者开展临床与科研实践的重要模式之一[1]。动物模型是医学实验研究过程中的重要载体，以中医基础理论和病证结合理论为指导，构建出既符合西医疾病特征又具备中医证候特点的规范化病证结合动物模型，是开展中医药现代化研究的重要内容之一[2-3]。

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身骨骼代谢性疾病，已成为全球范围内严重危害人们健康的常见慢性疾病之一[4-6]。在我国，有学者研究表明以-2SD为诊断标准预测40岁以上人群OP发病率为19.74%，约有1.12亿患病人群[7]。OP覆盖人群广泛且严重影响人们的生活质量，所需的医疗费用给社会造成了极大的经济负担。中医药是我国独特的医疗卫生资源，在OP防治方面具有一定的优势。近年来，兼具西医疾病特点和中医证候特征的OP病证结合动物模型相继构建成功，并应用于中医药干预OP等多方面的研究，为揭示中医药疗效及深入了解OP相关机制奠定了一定的基础。本文旨在对目前常用的OP动物模型和病证结合动物模型的构建及评价方法进行总结，以期为OP的实验研究提供参考。

1 骨质疏松症动物模型

OP发病机制十分复杂，骨代谢疾病一直是骨科等相关领域研究的热点。经过长期的实践探索，OP动物模型构建类型纷繁多样(见表1)，如：手术诱导型[8-13](去势摘除双侧卵巢/睾丸[8])、药物诱导型[14-18](肾上腺皮质激素等药物[14-15])、失用诱导型[19-20]、饮食诱导型[21-22](低钙饮食[22])、基因敲除型[23-24](RANKL等基因[23])、自然退变型[25-26]等。造模动物的选择也具有多样性，常用的有SD或Wistar大鼠、小鼠，兔、羊、猪、犬和猕猴等动物较少应用。造模的时间一般集中在2个月左右。OP模型因研究内容不同而各具特点，如谷氨酸单钠药物诱导的模型适用于脑源性骨质疏松研究[16]，SAMP6小鼠更适用于老年性OP研究[25-26]。但不论如何，理想的OP模型至少需要符合以下两点：一是简便，构建模型的方法简单，可控性和可操作性强，造模周期较短，能较好的模拟OP发生和发展的过程；二是验廉，动物模型应与人体条件具有一致性，能最大程度反映人体的机能状态，且模型验证具有较强的可重复性，造模费用适中等。伴随OP模型的构建成功，其评价标准也不断发展完善，主要包括骨密度测定、病理学骨组织形态观察、生化指标检测分析、骨生物力学指标测试等[27-31](见表2)，多手段综合评估方法在OP动物模型评价方面凸显出关键作用。

2 骨质疏松症病证结合模型构建

中医古籍中虽没有“骨质疏松症”的病名，但根据其病因病机及临床表现，可将本病归为“骨枯”、“骨痹”、“骨痿”等范畴。OP的发生发展是多脏腑共同作用导致的，其中肾亏为主要病因，肝虚乃关键因素，脾虚是重要病因[32]。肾主骨而生髓，为全身各脏阴阳之根本，若肾精亏乏则骨髓生化无源，全身结构功能受到影响，脏腑功能衰退而致骨痿，故肾虚精亏是主要病因；肝主身之筋膜，《证治准绳》中记载：“肝虚无以养筋，故机关不利。”故肝血虚而不能濡养筋膜，肝气衰则筋不能动，导致活动受限，故肝虚乃关键因素；脾乃后天之本，其在体合肉主四肢，脾胃虚弱则气血生化不足，先天之精无以资养后天之精血，日久遂致髓少骨松，故脾虚是重要病因[33]。肾、肝、脾三脏相互联系、相互影响，共同参与OP的生理病理全过程。中医药在骨质疏松的防治方面疗效确切，临床上多采用补益肝肾、补脾益肾等治法厘定处方进行治疗，笪巍伟等[34]研究表明通过补“先天”和养“后天”的方法及基于此理论指导下的健脾补肾方[35]均可以促进骨质疏松性模型小鼠骨折的愈合，其他的经典名方如左归丸[36]、右归丸[37]等方剂同样作用明显，但具体相关作用机制却尚未明确[38]。动物模型已经成为开展医学相关研究的必备手段，尽管目前已经建立了诸多用于OP研究的动物模型，但根据传统理论指导的具有中医特色的病证结合研究模型甚少，成为制约中医药、中西医结合医学工作者开展OP研究的因素之一。

表2 骨质疏松症常用动物模型评价方法Table 2 Common animal model evaluation method for osteoporosis

目前，OP病证结合动物模型主要有三种(见表3)：①肾阳虚证[39]：陈剑磨等[40]将去势小鼠(摘除卵巢)骨质疏松模型与氢化可的松诱导的肾阳虚模型结合起来构建OP肾阳虚病证结合模型，并通过观察造模小鼠的症状体征、检测促肾上腺皮质激素等生化指标、骨密度检测、骨形态组织病理观察等方法对模型进行评价。与对照组相比，病证结合模型组小鼠出现肾阳虚症状，且促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素的水平降低，股骨及腰椎的骨密度下降，病理学观察骨小梁排列稀疏且较细，破骨细胞数目增多等。因此，其得出结论认为造模成功，且方法是稳定可靠的；②肾阴虚证：夏炳江等[41-42]在去势小鼠OP模型的基础上灌服甲状腺片混悬液构建复合的肾阴虚模型，或者通过单独臀肌注射地塞米松磷酸钠构建OP肾阴虚模型，其表明这两种造模方法均能够使造模后小鼠具有肾阴虚和OP的症状和体征，与对照组相比，病证结合模型组体重增加缓慢，雌二醇水平降低，环磷酸腺昔/环磷酸鸟昔的比值升高，骨密度检测也明显发生改变，结果表明该模型是可行的，且其造模干扰因素较少，可操作性和可控性较强；③脾肾两虚证：刘梅洁等[43]通过去势和中药大黄灌胃两种方法结合构建脾肾两虚复合型OP模型，动态观察大鼠的行为方式，并采用检测大鼠骨量、骨吸收等指标对模型进行评估。结果表明脾肾两虚模型组大鼠出现与临床较吻合的脾虚证证候特征，与假手术组相比，其骨小梁体积百分比显著降低，骨小梁吸收表面和形成表面百分比、骨小梁和骨皮质矿化率均显著增高，该模型能较大程度的符合临床的发病特点，具有可行性。

3 存在的问题及展望

采用病证结合动物模型研究疾病发生机制与干预措施作用机制已成为中医药研究的重要内容，是中医药现代化研究中不可或缺的部分。OP病证结合动物模型在疾病造模的基础上取得了一定的成绩，但不可否认，其模型构建还存在一些问题与争议，暴露出一系列亟待需要解决和引起重视的问题。第一是造模思路，目前OP病证结合模型的造模方法仅停留在疾病模型的基础上加载中医病因，从而模拟形成相应的中医证候以构建模型，简单的复合造模方法与临床实际病证结合的理念尚存在偏差。中医辨证是建立在四诊合参基础上，通过望闻问切识别，而在动物造模过程中无法全面提取四诊资料，只能通过简单观察或根据仪器进行相关检测，因此，无法客观对临床证型进行复制，证型的确定在一定程度上具有主观选择性。同时，在造模过程中干扰因素众多，容易影响模型的稳定性和可靠性；第二是模型评价，OP病证结合动物模型评判尚缺乏统一标准，造模目前主要采用骨密度测量、生物力学指标观察、血液学指标检测等手段，缺乏具有中医药自身特色的标准评价体系和观察指标，因此，国内外对病证结合模型的认可度一直存疑；第三，OP病证结合模型报道相对较少，目前应用较多的仅有三种模型。然而，OP为本虚标实疾病，瘀血致病理论在OP当中同样具有重要意义，但尚未见到血瘀证或者肾虚血瘀证病证结合模型的报道。在未来研究中，笔者认为OP病证结合模型的构建可以借鉴其他疾病病证结合模型构建的方法，如类风湿性关节炎等。如今高通量测序及各种组学技术快速发展，OP病证结合模型的研究可以借助这些先进的技术手段进行系统研究，寻找出中医证候与OP之间的生物学关系，从宏观与微观、整体与局部相结合的角度，更深入阐明中医药治疗OP的作用机制。

表3 骨质疏松症常用病证结合模型总结 Table 3 Summary of the syndrome combination model commonly used in osteoporosis

总之，OP病证结合动物模型尚处于探索阶段，距离构建客观、全面、稳定的动物模型仍存在较大差距。因此，必须秉承动物模型研究真实性、稳定性、可行性、经济性等原则，继续优化模型的构建方法，完善模型的评价体系，加大模型的研发力度，利用学科交叉进行创新，把握好中医药现代化发展的历史机遇，构建出更加贴近临床实际的国际公认的OP病证结合模型。