辛基酚对萼花臂尾轮虫毒性效应的研究

李若男，王再兴，夏洋，吴建新，陆正和

（淮海工学院海洋生命与水产学院，江苏 连云港 222005）

环境激素对人类及动物健康的影响已日益引起人们关注[1]。烷基酚聚氧乙烯醚（APEs）为非离子表面活性剂，广泛应用于洗涤用品、塑料、杀虫剂等方面，随着工农业的发展，其对水体的污染日趋严重。辛基酚（Octylphenol，简称OP）为APEs的合成原料和主要降解产物，目前在土壤和水体中已有发现，为雌性激素最强的烷基酚类化合物，能够干扰动物的内分泌系统，对动物生长、发育和生殖造成危害[2]，对鱼类的生殖影响也有报道[3-5]，但OP对水生浮游动物轮虫的影响未见报道。

轮虫为淡水浮游动物的重要组成部分，具有分布广，繁殖快，生活周期短，易培养，为鱼类良好的开口饵料。同时也是水生态毒理学研究中常用的模式动物[6]。其中24 h急性毒性和生命表参数研究为评价环境激素对轮虫毒性常用的方法[7-8]，同时研究发现轮虫的有性生殖较无性生殖对环境激素敏感，因此利用轮虫的生殖评估环境激素效应已成为当前研究的热点[9]。鉴于目前水体中OP污染有加剧趋势，该文以萼花臂尾轮虫为受试动物，研究OP对轮虫主要生殖影响为利用评价OP潜在危害提供参考。

1 材料与方法

1.1 轮虫的来源和培养

萼花臂尾轮虫（Brachionus calyciflorus，简称轮虫）采自淮海工学院校园池塘，挑选单个孤雌生殖雌体，驯化培养2个月后，大量培养并诱导其种群产生休眠卵，以后试验所用的轮虫为休眠卵孵化而来，孵化使用EPA培养液（96 mg NaHCO3，60 mg CaSO4，60 mg MgSO4和 4 mg KCl，1 L 去离子水），温度（25±1）℃，光强 200 lx，L∶D=12∶12，时间 24 h，轮虫饵料为蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），该藻使用HB-4培养液培养，达到指数增长期后收集离心，EPA稀释成所需浓度投喂[10]。

1.2 OP对轮虫急性毒性试验

试验用 OP（4-tert-octylphenol，分析纯 99.0%，Sigma-Aldrich公司），先用丙酮将这种酚类物质配成100.0 mg/L母液，然后用EPA将母液稀释到所需试验浓度，1周用完。在预试验基础上，配制OP浓度为 0.2、0.4、0.8、1.6和 3.2 mg/L，以上浓度中丙酮浓度不超过（0.2%）另设丙酮（0.2%）对照组和空白对照组。挑选刚孵出的轮虫幼体20只，放入到容有2 mL测试液的培养板中，每个浓度设4个重复。试验在（25±1）℃，无光的培养箱中进行，24 h后解剖镜下观察并记录每孔中轮虫死亡数，对死亡数据采用SPSS 17.0软件中Probit法计算OP对轮虫24 h的半致死浓度LC50。

1.3 OP对轮虫主要发育阶段和产卵量影响

根据LC50值，配制 OP浓度为 0.01、0.02、0.04、0.08和 0.16 mg/L（分别约为 LC50的 1/90、1/45、2/45、4/45、8/45），另设丙酮（0.2%）对照组和空白对照组。试验开始时，取刚孵出的轮虫幼体（＜2 h）1个接入容有1 mL以上测试液（内含0.5×106cells/mL小球藻）的细胞培养板中，为防藻类和轮虫沉底，每6 h悬浮试管底部藻液，试验开始的48 h，每隔3～4 h观察1次，记录轮虫首次产卵及产幼时间，最后1次产卵时间和产幼时间并记录轮虫产卵数，及时移去新生的幼体，每隔24 h更换1次培养液，各测试组重复5次，试验至全部个体死亡为止[11]。

1.4 OP对轮虫2 d的r和7 d休眠卵产卵影响

取刚孵出的轮虫幼体6个，接入到含有12 mL以上测试液的14 mL的试管中（内含3.0×106ells/mL小球藻），每6 h悬浮试管底部藻液，2 d后将试管中轮虫倒入培养皿中统计轮虫数量，统计后将所有轮虫全部移入原来试管中继续培养，7 d后统计轮虫休眠卵的数量，休眠卵数量包括携有性雌体所携的休眠卵，试验设丙酮对照组与空白对照组，每组设5个重复，试验在温度（25±1）℃，黑暗中进行[12-13]。

1.5 相关参数的定义和分析方法

各主要发育阶段：胚胎发育期（指从卵产出到幼体孵出所经历的时间）；繁殖期（幼体孵出到产第1枚卵所经历时间）；繁殖期（指从第1枚卵产出到最后1枚卵产出经历时间）。

平均寿命（繁殖前期、繁殖期、繁殖后期之和）；r：种群增长率（population growth rate）：r=(lnNt-lnN0)/t，Nt和N0分别为试验经过t天和试验开始时的种群数量，t=2 d；休眠卵产量（resting egg production，RE）：轮虫在7 d内所产的休眠卵数量。

对试验结果使用SPSS软件进行方差分析（one-way ANOVA），对于有统计学意义差异的与对照组相比进行Dunnett's分析，使用sigmaplot 11.0作图和数据进行拟合。

2 结果与分析

2.1 OP对轮虫24 h急性毒性

24 h急性毒性下丙酮对照组与空白对照组中轮虫病死率分别为5.0%与3.75%，经t检验无统计学意义差异（P＞0.05），因此可得出该试验中丙酮添加对试验结果无显著影响。通过空白对照组进行LC50计算，OP浓度对数与病死率关系见图1。从图1中可以看出，24 h急性毒性试验中，轮虫病死率随着OP 的浓度增加而上升，OP 浓度0.2、0.4、0.8、1.6 和3.2mg/L下，轮虫病死率分别为8.75%、23.75%、42.5%、65.0%和92.5%，通过Probit计算方程Y=2.14X+0.214，（Y 概率值，X 为浓度对数），LC50为 0.91 mg/L，95%置信限为 0.66～1.27 mg/L。

图1 OP浓度对数与病死率关系

2.2 OP对轮虫主要生活阶段和产卵量影响

OP对轮虫主要发育阶段历时和产卵量影响见表1。从表1中可以看出，丙酮对照组与空白对照组之间对轮虫的生殖前期、生殖期、生殖后期、平均寿命及产卵量无显著影响（P＞0.05），而OP显著影响以上指标（P＜0.05）。与对照组相比，OP浓度在0.08、0.16 mg/L显著降低轮虫生殖前期、生殖期、生殖后期和平均寿命（P＜0.05），其他浓度无显著影响（P＞0.05），OP浓度在0.04 mg/L显著降低轮虫的生殖量（P＜0.05），而以上测试浓度对轮虫胚胎发育无影响（P＞0.05）。

表1 OP对轮虫主要发育阶段历时和产卵量影响

2.3 OP对轮虫2 d生殖参数影响

试验显示丙酮对照组与空白对照（0 mg/L）无统计学意义差异（P＞0.05），但空白对照组与浓度为0.08和0.16 mg/L轮虫2 d的r具有统计学意义差异（P＜0.05）。OP对轮虫2 d的r影响情况见图2。对OP与r值效应关系，从图2中可以通过Four-parmeter logstic方程Y=min+(max-min)/[1+x/EC50]-Hilslope得到很好拟合，得出曲线为Y=0.49+(0.825-0.49)/(1+(x/EC50)-3.82，半效应浓度 EC50为0.053 mg/L。

图2 OP对轮虫2 d的r影响

2.4 OP对萼花臂尾轮虫7 d的休眠卵影响

OP对轮虫7 d的休眠卵影响见图3。从图3中可以看出，OP浓度对轮虫7 d的休眠卵产量具有显著影响（P＜0.05），从浓度为 0.01～0.16 mg/L，轮虫7 d所产休眠卵产量平均分别为 21.4、11.4、12.2、6.8 和4.4个，而丙酮对照组和空白对照组休眠卵产卵分别为 32.6和 30.2个，无统计学意义差异（P＞0.05），而其他浓度组所产休眠卵产量与空白对照组相比呈显著下降（P＜0.05），对浓度与休眠卵产量效应关系，利用Four-parmeter logstic方程Y=min+(max-min)/[1+x/EC50]-Hilslope拟合，得出曲线为Y=3.78+(30.35-3.78)/(1+(x/EC50)-1.22，EC50为 0.014 mg/L。

图3 OP对轮虫7 d的休眠卵影响

3 讨论

3.1 OP对轮虫的24 h急性毒性

OP为烷基酚类化合物中具有代表性的环境雌激素，有关其对水生动物的急性毒性影响已有报道，如OP对泥鳅 24的LC50分别为 3.27 mg/L[14]，对中国林蛙蝌蚪的LC50为0.73 mg/L[15]。该研究显示OP对轮虫24 h的LC50为0.91 mg/L，因此利用轮虫24 h急性毒性评价OP明显比泥鳅24 h毒性急性敏感，但敏感性低于中国林蛙。

3.2 OP对轮虫主要生活阶段和生殖量影响

由于OP对水生动物的生长、发育和生殖具有潜在的毒性作用，因此利用水生动物上述指标评价OP环境激素效应具有明显的优势。如刘正涛等研究了OP对大型溞21 d的生殖影响，发现OP浓度0.08 mg/L能降低大型溞的生殖量降低，增加溞类后代中雄性比例[16]；OP浓度0.45 mg/L能降低日本青鳉卵孵化率，使鱼鳔发育异常[17]；OP对斑马鱼胚胎发育72 h的半效应浓度为0.5 mg/L[18]。

与鱼类等动物相比，轮虫具有个体小，生命周期短，易培养、对毒物敏感强等优点，因此在评价环境激素效应方面具有一定优势。该研究结果显示，OP浓度0.08、0.16 mg/L虽对轮虫胚胎发育无影响，但对个体的成熟（生殖前期延长）、生殖生殖期及寿命都具有抑制作用，徐晓平等研究溴氰菊酯对萼花臂尾轮虫生殖时也发现类似结果，其推测生殖前期的延长可能是导致轮虫种群增长下降的主要原因[19]。

OP浓度0.02 mg/L时显著延长轮虫的生殖期，但浓度0.08、0.16 mg/L显著降低轮虫生殖期、寿命、生殖量，推测轮虫可能在OP低剂量胁迫下对生殖、寿命与生殖量之间进行生态策略的权衡，但在高剂量毒性作用下，轮虫对以上权衡指标被破坏，使得上述指标下降。该研究显示轮虫生殖量比生活阶段历时在评价环境激素效应时具有较高的敏感性，因此，轮虫生殖量为评价OP环境激素效应时具有一定优势。

3.3 OP对轮虫2 d的r值影响

鱼类的卵黄原蛋白（VTG）常作为评价污染物具有环境雌激素效应的标记物之一。吴翠琴等[3]研究发现OP浓度0.02 mg/L能够显著诱导真鲷幼鱼产生VTG，宮向红等[4]研究发现OP浓度0.01 mg/L能诱导鲤鱼幼鱼产生VTG，而该浓度对鱼的生存率、性腺指数没有变化。雷忻等[20]研究发现OP浓度0.12 mg/L能够诱导泥鳅雄鱼产生VTG，而该浓度对泥鳅肝脏的SOD、CAT无显著影响，该研究显示轮虫暴露在OP浓度0.08 mg/L下2 d的r显著下降，利用轮虫2 d的r评价OP环境激素效应时其敏感性明显低于真鲷和鲤鱼，但高于泥鳅。Snell等也认为轮虫2 d的生活周期测试评价毒物敏感性高于24 h急性毒性LC50值，该研究显示轮虫2 d的r的EC50为0.053 mg/L，明显低于24 h的LC50为0.92 mg/L。

3.4 OP对轮虫7 d休眠卵产量影响

轮虫休眠卵为有性生殖的最终产物，其形成受温度、盐度、污染物等因素影响。Preston等[21]研究表明，萼花臂尾轮虫种群暴露在PCP浓度0.0025 mg/L和Cu2+浓度0.005 mg/L下其4 d休眠卵产量与对照组相比显著下降，但上述浓度对轮虫病死率、游泳行为、种群增长、混交率等指标却无显著变化。轮虫种群暴露在二嗪农、杀螟硫磷等农药下7 d休眠卵产量也与出现类似现象[22]，对此Snell等[13]研究认为轮虫休眠卵产量为评价环境激素效应最敏感的指标。该研究结果显示OP浓度0.01 mg/L能显著降低轮虫7 d的休眠卵产量，显示轮虫7 d休眠卵产量评价OP环境激素效应比轮虫生殖阶段指标敏感、2 d的r敏感，同时也发现该浓度比泥鳅，真鲷诱导VTG所需的OP浓度要低[3]，因此轮虫休眠卵产量在评价OP环境激素效应方面具有操作简单，费用较少等优点。

综上所述，水体中OP超过一定浓度会干扰轮虫的生殖，最终会影响轮虫的种群数量变化，其种群变化及OP通过食物链传递可能会对鱼类的生长、发育及生殖产生影响，因此有必要对水体中OP进行监控，防止其对水体的进一步污染。

飓风多里安致加拿大贝类养殖业受灾

2019年9月8日，大西洋飓风多里安（Dorian）横扫北美，在加拿大沿海地区制造100 mm强降水，加拿大海洋渔业局通知，爱德华王子岛、新斯科舍省和新不伦瑞克省的贝类收成要暂停一周以上。

渔业局称，食用被污染的贝类可能造成严重的疾病甚至死亡，即便高温煮熟也不能降解毒素。

新斯科舍水产养殖协会主席Tom Smith表示，飓风多里安使该地区多处牡蛎、贻贝、蛤蜊、扇贝和海藻的养殖遭遇损失，尤其是牡蛎养殖业，受损率达到了50%以上。2018年，新斯科舍水产养殖业收入超过1.2亿加元。

加拿大媒体CBC报道，飓风过后几十家爱德华王子岛贻贝和牡蛎养殖户的灾后清理活动持续了一周，目前还无法估算损失额。该地区拥有130家贻贝养殖场，年产量18 600 t，占加拿大产量的80%，产值约6 000万加币；牡蛎养产量约907 184.74 kg，产值200万加元。

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