高效液相色谱法检测ATP、ADP、AMP分离方法的优化

(1.首都医科大学中心实验室，北京 100069；2.首都医科大学药学院，北京 100069)

1 前言

5-三磷酸腺苷( adenosine5 -triphosphate，ATP) 是肌肉收缩的唯一直接能量来源[1]，是生物体组织维持正常生命活动所必需的能量物质，三磷酸腺苷二钠(ATP-2Na)为辅酶类药，在临床上用于治疗进行性肌萎缩、脑溢血后遗症、心功能不全、心肌疾患及肝炎等病症。二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)是ATP的降解产物，也是引起疲劳的重要因素之一[2],因此ATP、ADP、AMP与生命活动息息相关。目前，国内检测ATP、ADP、 AMP的方法较多，HPLC-MS/MS法[3]、离子对反相色谱法[4-7]和高效液相色谱法[1，2,8-13]。中华人民共和国药典[4]给予了标准检测方法，但由于方法中应用的离子对试剂，对色谱柱有一定的损害，使色谱柱的使用寿命降低。参考文献[1，2,8-13]的方法由于使用的色谱柱不同等诸多因素，方法往往较难重现，本研究根据文献[9]的方法进行了优化。

2 试验部分

2.1 仪器与试剂

三磷酸腺苷二钠(ATP)、二磷酸腺苷二钠(ADP)、一磷酸腺苷二钠(AMP)均为送检者提供。磷酸二氢钠AR，纯度≥99.0%(北京化工厂)；磷酸氢二钠AR，纯度≥99%(shanghai Macxlin Biochemical Co ltd，中国)；甲醇为色谱纯(Fisher，美国)。

Waters2695-2489 液相色谱(waters公司，美国，waters2695包含四元泵系统 ；自动进样器；在线脱气机；柱温箱。2489是双波长紫外检测器，波长范围190～800nm)；色谱柱：Atlantis T3( 4.6*150mm 5μ，waters公司美国)，symmetryshield RP18 (4.6*250mm 5μ，waters公司，美国)。

2.2 试验方法

2.2.1色谱条件

流动相：A：0.05mol/L磷酸缓冲盐，pH5.85，B:甲醇；检测波长254nm；流速1.0mL/min；进样量10μL；柱温：室温。

梯度洗脱程序见表1。

表1 泵梯度洗脱程序表

2.2.2样品的配置

样品：由送检者提供。

加标样品的配制：取20μL样品加入标准品20μL，混合均匀，作为加标样品。

未加标样品的配制：取样品20μL加入水20μL，混合均匀，作为未加标样品。

3 结果与讨论

3.1 色谱柱的选择

色谱柱是液相色谱分离中的核心部件，正确选择色谱柱，是实验成功的关键。基于本实验室的条件和ATP的极性，结合参考文献[9]的实验方法和色谱柱的选择，首先考虑用于分离极性物质的AtlantisT3(4.6*150mm 5μ)柱和表面键合极性基团的symmetryshield RP18(4.6*250mm 5μ)的色谱柱，这两款色谱柱均可用100%水相。通过样品加标和样品不加标及标准品色谱图对比寻找目标化合物，结果如图1所示。

图1 不同色谱柱在0.03mol/L磷酸缓冲盐时，样品加标与未加标及标准品色谱图a. T3色谱柱在缓冲盐0.03mol/L样品未加标的色谱图;b . T3色谱柱在缓冲盐0.03mol/L样品加标后的色谱图;c.symmetryshieldRP18色谱柱缓冲盐在0.03mol/L样品未加标的色谱图;d .symmetryshield RP18色谱柱缓冲盐在0.03mol/L样品加标的色谱图;e .symmetryshield RP18色谱柱缓冲盐在0.03mol/L标准的色谱图

通过图1a和图1b及图1e比较，在AtlantisT3色谱柱中，目标化合物ATP不能确定，这可能是目标化合物隐含两个杂质峰之间，较难被发现，目标化合物ADP和AMP很容易被找到，从ADP的峰高来看，加标样品的峰高与未加标的样品峰增高不成比例，很可能ADP的峰存在共馏分。通过图1c和图1d及图1e比较，在symmetryshield RP18这款色谱柱中，三个目标化和物ATP、ADP、AMP均比较清晰，但目标化合物ATP与前面的杂质未分开，其分离度<1.5。由此可见symmetryshield RP18的分离效果优于Atlantis T3柱。这可能是因为，选用的symmetryshield RP18的柱子比Atlantis T3长。柱子越长，其柱效越高，分离效果越好。基于实验室的条件，因此选择symmetryshield RP18这款色谱柱作为实验用色谱柱。

3.2 缓冲盐离子强度的优化

图1c和图1d比较发现：缓冲盐浓度在0.03mol/L时，ATP不能和前面的杂质有较好的分离。把缓冲盐的浓度增加到0.05mol/L，通过样品加标与样品未加标、标准品进行对比，寻找目标化合物，分离效果如图2所示。

图2 symmetryshield色谱柱在0.05mol/L磷酸缓冲盐，柱温为室温时样品加标与未加标的色谱图a .0.05mol/L磷酸缓冲盐，柱温为室温时样品加标后的色谱图;b .0.05mol/L磷酸钠缓冲盐、柱温为室温时样品未加标的色谱图

实验结果表明：图2a和图2b所示色谱图分离效果可以看出，0.05mol/L的缓冲盐优于0.03mol/L，缓冲盐浓度在0.03mol/L时，ATP与前面的杂质峰未完全分离，而0.05mol/L的缓冲盐ATP与前面的杂质完全分开，分离度为1.5477。这是因为缓冲盐的离子强度可以抑制硅胶表面的硅醇基的活性，减小拖尾，从而改善分离。

3.3 柱温的优化

柱温选30℃和室温在缓冲盐在0.05mol/L的浓度下，通过样品加标和未加标样品进行比对，结果如图3所示。

通过图3a和图3b进行比对，目标化合物ATP的色谱峰不明显，有可能隐含在保留时间4分多钟的杂质峰内，目标化合物ADP也与前面的杂质峰未分开，分离度只有0.867。图3a和图2a 相比，显然室温的分离效果更好，这可能是由于柱温的增加，使得流动相的黏度降低，目标化合物溶解度增加，保留减弱。由于ATP的保留比较弱，增加柱温后，保留更弱，不利于与杂质峰的分离。因此室温更适合ATP、ADP、AMP的分离。

图3 symmetryshield色谱柱在0.05mol/L磷酸缓冲盐，柱温在30℃样品加标与未加标的色谱图a.10.05mol/L磷酸缓冲盐，柱温在30℃样品加标的色谱图;b .0.05mol/L磷酸缓冲盐，柱温在30℃样品未加标的色谱图

4 结论

通过比较两种色谱柱的分离效果，确定色谱柱后，再通过改变缓冲盐的浓度，和柱温的比较优化ATP、ADP、AMP的分离条件，最后确定实验条件为使用symmetryshield RP18 (4.6*250mm 5μ)色谱柱，磷酸缓冲盐浓度0.05mol/L，室温。分离度分别为1.5477、1.6459、3.855，符合中国人民共和国药典关于分离度的要求。