超声辅助醇提商洛金银花黄酮工艺优化研究

何 军

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

金银花，又名忍冬(FlosLonicerajaponica)，忍冬科忍冬属多年生半常绿缠绕及匍匐茎的灌木，我国常用大宗中药材[1-2]。从其植株中分离出有机酸[3]、黄酮[4]、挥发油[5]、多糖[6]等200多种化学成分[7]，除绿原酸之外，黄酮类化合物也是其主要有效成分之一，具有显著的抗氧化作用[8-12]，在临床上有保肝利胆、抗肿瘤、降血糖血脂的功效[13-14]，因此黄酮含量的高低也是评判金银花质量的标准之一[15]。

金银花在商洛山区的分布十分广泛，种植面积逐年扩大，自2008年以来，以商州、镇安、柞水、山阳、丹凤为中心，在南北山区的800～1200 m区域的山坡地带集中建立了金银花基地13333.3 hm2，其中建立野生抚育基地6666.7 hm2。金银花在商洛的收购量占到全省总收购量的50%以上[16]，是陕西省金银花的第一主产区，它包括金银花在内的“商药”品牌正在成为商洛的一张名片，正在扮靓商洛中药产业，并辐射带动整个陕南地区及毗邻省区中药产业的发展。

目前，金银花产业的发展仍然以种植业为主，产品加工处于初级形态，工业规模小，加工工艺落后，商业也很薄弱，整个产业头重脚轻，发展极不平衡，严重制约了当地中药产业的发展。鉴于此，本文以商洛市金银花为材料，在传统醇提取法的基础上，采用超声辅助处理，提取其有效成分，探索出一条既经济、高效，又适合商洛当地生产的提取工艺，以期为商洛当地金银花资源的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

金银花(购于商洛市洛南县麻坪镇陈台村8组)，将其放于60 ℃恒温干燥箱进行烘干，除杂，粉碎，过60目国家标准检验筛，之后各用密封袋包装并置于干燥器内备用。

1.2 试验试剂

芦丁标准品HPLC≥99%(成都埃法生物有限公司)，NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、无水乙醇，均为分析纯。所用水均为去离子水。

1.3 仪器设备

多功能中草药粉碎机(750T)，低温高速离心机(TDL-5A)，电热鼓风干燥箱(101型)，电子精密天平(FA1104)，超声波处理器(KQ5200E)，紫外可见分光光度计(UV-1780)。

1.4 试验方法

1.4.1 提取工艺 传统方法有水提法[17]、醇提法等[18-19]，随着科学技术的发展，出现了许多新型提取方法，如微波辅助提取法[20-21]、超声波法[22]、超临界流体萃取技术等[23-25]。

在参考文献的基础上，本试验采用超声波法辅助提取的工艺，其流程为：金银花→干燥→粉碎→超声辅助提取→离心(4000 r/min)20 min→取一定量上清液→稀释一定倍数→亚硝酸钠-硝酸铝比色法→测定。

1.4.2 标准曲线的制备 精密仪器准确称取经充分干燥的芦丁粉末5.0 mg，用75%乙醇温水浴中溶解后，移至25 mL容量瓶中定容至刻度，即为0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液摇匀备用。准确量取0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL的容量瓶中，各加入1 mL的5% NaNO2溶液混匀，6 min后各加入1 mL的10% Al(NO3)3混匀放置6 min，再加入10 mL的4.3% NaOH溶液，75%乙醇定容摇匀，放置15 min，以空白液为对照，在510 nm波长下测定各浓度标样的吸光度。以吸光度A作为纵坐标，以总黄酮的浓度C作为横坐标绘制标准曲线。

1.4.3 黄酮含量测定方法 本试验参照汪秀妹[26]采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定金银花总黄酮含量。将试样液稀释10倍，移取6 mL于25 mL容量瓶中，按照其2.2.1章节所叙述的标准曲线制作的方法测定其吸光值，通过回归方程计算各样品中黄酮的含量。再按下式计算总黄酮的提取率。

X=(C×V×F)/(m×1000000)

式中：X为样品中黄酮类化合物含量(%)，C为依据标准曲线计算出被测液中黄酮浓度(μg/mL)，m为样品的质量(g)，F为稀释倍数，V为待测液的总体积(mL)。

1.4.4 单因素试验 本试验采用超声波辅助乙醇法提取金银花总黄酮，在参照文献的基础上，研究发现，影响金银花得率的因素有超声功率、超声提取温度、超声提取时间等，本研究选择了超声提取温度、乙醇浓度、料液比、超声提取时间作为主要影响因子，研究它们对金银花总黄酮得率的影响。单因素试验设计如下：

超声温度：35、45、55、65、75 ℃；乙醇浓度：25%、40%、55%、70%、85%；料液比(m/v,g/mL)：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50；超声时间：30、40、50、60、70 min。

1.4.5 正交试验研究 在单因素试验的基础上，在每个因素里面选择对金银花中总黄酮提取率影响较大的3个水平，设计L9(34)正交试验，以商洛金银花总黄酮的提取率为检测指标。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

根据试验测定结果，得到的标准曲线回归方程为：y=11.546x-0.0845 (R2=0.9996)，其中y值为吸光度(Abs)，x值为芦丁标准溶液浓度(mg/mL)。芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准溶液的标准曲线

2.2 单因素研究

2.2.1 不同超声提取温度对金银花总黄酮提取的影响 精确称量金银花样品5.0 g，选取超声温度为35、45、55、65、75 ℃，乙醇浓度55%，料液比1∶20，超声浸提时间为30 min。超声温度对黄酮提取率的影响结果见图2。

图2 不同超声提取温度对金银花总黄酮提取的影响

由图2可知，总黄酮提取率最高为1.81%，黄酮类化合物是一种天然的抗氧化剂，所以它本身容易在高温下氧化。当温度在45～65 ℃时，得到的黄酮提取率为最高。一旦超过55 ℃，黄酮的提取率就会下降，这可能是因为在高温下部分黄酮被氧化了。故选超声温度45、55、65 ℃进行正交试验分析。

2.2.2 不同乙醇浓度对金银花总黄酮提取的影响 精确称量金银花样品5.0 g，选取乙醇浓度25%、40%、55%、70%、85%，以1∶20的料液比，在55 ℃下超声浸提30 min。乙醇浓度对金银花总黄酮提取率的影响见图3。

图3 不同乙醇浓度对金银花总黄酮提取的影响

由图3可知,随着乙醇浓度的增加，黄酮的提取率也相应提高，得到的最大值为1.39%，但乙醇浓度超过55%后，黄酮的提取率反而降低。这可能是因为某些黄酮类物质的溶出被高浓度的乙醇限制了。故选乙醇浓度40%、55%、70%、进行正交试验分析。

2.2.3 不同料液比对金银花总黄酮提取的影响 精确称量金银花粉末5.0 g，选取料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，乙醇浓度55%，在55 ℃下超声浸提30 min。料液比对金银花总黄酮提取率的影响见图4。

以乙醇为溶剂提取时，适当加大料液比，可将更多的被提取物质提取出来。由图4可知，用乙醇提取金银花中总黄酮时，黄酮提取率会随着随着料液比的加大而加大，但当料液比超过1∶30时，黄酮的提取率增加不大，金银花黄酮最大提取率为1.72%。故选料液比1∶20、1∶30、1∶40进行正交试验分析。

图4 不同料液比对金银花总黄酮提取的影响

2.2.4 不同提取时间对金银花总黄酮提取的影响 精确称量金银花样品5.0 g，选取超声时间30、40、50、60、70 min，乙醇浓度55%，料液比1∶40，超声温度55 ℃。提取时间对金银花总黄酮提取率的影响见图5。

图5 不同提取时间对金银花总黄酮提取的影响

由图5可知，随着溶剂在金银花中慢慢地渗入，黄酮类化合物溶于乙醇溶液而被提取出来。如果增加适当的浸提时间，可使提取物质被更多地溶出。由图5可知，当提取时间为40～50 min时，黄酮的提取率最高达到1.59%；提取时间一旦超过50 min时，由于黄酮长时间在55 ℃的温度下暴露，部分黄酮可能就会被氧化，从而导致其提取率降低。故选40、50、60 min进行正交试验分析。

2.3 正交试验研究

2.3.1 因素与水平的确定 基于上述单因素试验结果，确定以乙醇浓度(%)、超声时间(min)、超声温度(℃)、料液比4个对金银花超声波法提取工艺影响的因素作为考察对象，以总黄酮得率作为考察指标，进行L9(34)正交试验，因素与水平见表1。

表1 单因素与水平

2.3.2 正交试验分析 制备9份样品，分别按表1进行正交试验设计，以黄酮提取率为考察指标进行直观分析，结果见表2。

从表2可以看出，极差最大的是A因素，其次为C因素、B因素，极差最小的是D因素，说明从金银花超声波辅助乙醇法提取总黄酮对含量影响最大的因素为超声提取温度，其次为料液比和乙醇浓度，提取时间的影响最小。

表2 正交试验直观分析表

2.3.3 正交试验方差分析 商洛市金银花超声辅助法提取总黄酮正交试验方差分析结果见表3。从金银花超声波辅助提取总黄酮的正交试验方差分析结果可以看出(表4)，A因素(F0.05

表3 黄酮含量方差分析表

3 结论与讨论

3.1 结论

本文以乙醇为溶剂，利用超声辅助法提取商洛市金银花中总黄酮，在单因素试验基础上，结合正交试验分析，得出商洛市金银花中绿原酸最佳提取工艺为：乙醇质量分数40%、超声时间40 min、超声温度45 ℃、料液比1∶30，黄酮的提取率可达2.66%。

3.2 讨论

以正交试验结果为依据，参照最佳工艺参数对金银花总黄酮进行了提取，重复3次，得到金银花总黄酮提取率约为2.66%，与梁萱等[27]工艺相比较得率(1.1118%)较高；与贾霖等[28]用乙醇回流法提取金银花黄酮相比，使用超声波辅助法提取金银花黄酮显然有着操作简便、设备简易、绿色经济特点；比起黄小梅等[29]用超声波提取金银花黄酮的提取时间(2 h)足足缩短了80 min，故做到了节省时间；李晓军[30]所用温度80 ℃，与之相比温度较适中(45 ℃)，有效成分稳定、不易分解，效率较高。

因此本试验提出的新工艺具有综合成本低、污染较小、工艺简易、提取效率较高的特点，并且在实际操作中发现工艺非常稳定、重现性很好，可以为当地金银花资源的可持续利用提供借鉴。除上述之外，超声辅助法还可以有效地克服传统煎煮法提取中药材细粉易糊化、堵塞等问题。