红景天苷对小鼠抗血小板活性和抗血栓作用*

林晓坚， 袁兆伟， 潘彩燕， 孙黔云， 宛蕾**

(1.贵州医科大学 基础医学院 药理学教研室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省中国科学院 天然产物化学重点实验室， 贵州 贵阳 550014)

血栓性疾病是由血栓形成和血栓栓塞两种病理过程引起的一类疾病，前者是指血液中的有形成分在血管中形成栓子，造成血管部分或完全堵塞；后者则是指血栓自形成部位脱落，随血液循环部分或全部堵塞某些血管[1]。血栓性疾病有高死亡率和高致残率的特点，其中血小板活化异常是血栓形成的重要病理学基础[2-3]。抗血小板治疗已成为预防动脉粥样硬化性疾病，尤其是冠心病的重要治疗手段[4]，因此具有抗血小板活性的药物对于防治血栓有着重要作用。红景天是大花红景天(rhodiolaroseaL.)的干燥根茎和根，是藏医常用药材，红景天苷(salidroside，Sal)则是红景天的主要有效成分[5]。研究表明，Sal有广泛的药理作用，如抗氧化、抗动脉粥样硬化、心肌保护、神经保护、脑保护、抑制血小板聚集等[6-11]，但目前对其抗血小板活性和抗血栓作用研究少有报道。因此，本研究采用小鼠断尾出血时间和角叉菜胶诱导的体内血栓模型，观察Sal抗血小板活性和抗血栓作用，为临床抗血栓和抗血小板药物的研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物、试剂及仪器

1.1.1实验动物 清洁级昆明小鼠160只，体质量18～22 g，雌鼠60只，雄鼠100只，由贵州医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK(黔)2018-0001。实验前均适应性喂养3 d。

1.1.2药物及试剂 Sal购自上海瓦兰生物科技有限公司(批号HJT20180812，纯度≥98%)，角叉菜胶购自Sigma公司(22048-25G Type κ，批号BCBG5890V)，水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司(批号20170803)，二水合柠檬酸三钠购自国药集团化学试剂有限公司(批号20170718)，阿司匹林肠溶片购自大同市利群药业有限责任公司(批号170605)。

1.1.3仪器 BC-5130型全自动血液细胞分析仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，5810R型高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，移液器购自德国Eppendorf公司，XS205型万分之一电子天平购自瑞士梅特勒-托利多科学仪器公司产品，RP6002K型电子天平购自常州锐品精密仪器有限公司，RAC-1830全自动凝血分析仪购自美国Rayto公司。

1.2 方法

1.2.1体质量及血细胞数目的测定 取40只昆明小鼠，雌雄各半，随机分为对照组(生理盐水)、阳性药组(阿司匹林100 mg/kg)、Sal高剂量组(Sal 100 mg/kg)和Sal低剂量组(Sal 50 mg/kg)。每日称重小鼠，记录体质量，按照体质量腹腔注射给药1次/d，给药体积为10 mL/kg，连续7 d；末次给药30 min后，将小鼠麻醉(4%水合氯醛，400 mg/kg)、固定、采血(3.8%枸橼酸钠抗凝，抗凝剂与血液体积之比为1 ∶9)，检测白细胞(white blood cell，WBC)、红细胞(red blood cell，RBC)、血小板计数(platelet，PLT)和平均血小板体积(mean plate volume，MPV)。

1.2.2凝血4项的测定 取昆明小鼠40只，雌雄各半，分组给药同1.2.1。末次给药30 min后，将小鼠麻醉、固定、采血，检测凝血酶原时间(prothrombin time ，PT)、活化部分凝血酶时间(activated partial thromboplastin time， APTT)、凝血酶时间(thromboplastin time，TT)和纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)。

1.2.3小鼠断尾出血时间测定 取昆明小鼠40只，雌雄各半，分组给药同1.2.1。参照文献[12]末次给药30 min后，小鼠麻醉(4%水合氯醛，400 mg/kg)，在距离尾尖4 mm 处剪断，滤纸擦去第一滴血，随后将鼠尾放入37 ℃生理盐水中，待小鼠尾部停止流血后，继续观察60 s，如停止出血则以该时间为小鼠尾巴出血时间，若尾部再次出血则继续计时，到15 min出血未停止，则记为15 min。

1.2.4小鼠尾部血栓测定 取雄性昆明小鼠40只，随机分为4组，分组给药同1.2.1。腹腔注射给药1次/d，至第5天给药30 min后，各组腹腔注射角叉菜胶(20 mg/kg，10 mL/kg)[13]第6天、第7天按分组持续给药；分别测量并记录给予角叉菜胶12 h、24 h、48 h后的黑尾率以及黑尾长度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 体质量

各组小鼠实验开始时体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)；实验开始后各组小鼠每日体质量均有增长，腹腔给药第7天相较于给药第1天，各组小鼠体质量均有明显增加，差异有高度统计学意义(P<0. 01)，但同日各组小鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 血细胞、PLT和MPV

实验表明，各组小鼠WBC、RBC、PLT和MPV比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

时间小鼠体质量对照组(n=10)阳性药组(n=10)Sal低剂量组(n=10)Sal高剂量组(n=10)第1天21.14±0.9221.74±0.8421.89±0.7921.46±0.70第2天22.35±0.7222.57±1.1722.26±1.4321.99±1.67第3天23.30±1.0523.24±1.1723.40±1.2023.55±1.15第4天24.56±0.8324.11±1.4124.78±1.3924.73±1.22第5天25.17±1.4025.76±1.3925.21±1.2025.59±1.39第6天26.18±1.3526.29±1.1126.37±1.2426.61±1.30第7天26.83±1.41(1)27.04±1.48(1)27.43±1.35(1)27.34±1.37(1)

注：(1)与同组第1天比较，P<0.01。

指标对照组(n=10)阳性药组(n=10)Sal低剂量组(n=10)Sal高剂量组(n=10)FPWBC(×109/L)3.47±0.993.61±1.043.33±0.903.05±0.950.4920.994RBC(×1012/L)8.72±0.688.37±0.588.46±0.578.65±0.720.5720.877PLT(×109/L)559.60±91.60 566.10±107.30572.60±109.10543.10±146.800.1070.577MPV(fL)5.54±0.355.83±0.395.63±0.405.66±0.460.8230.490

2.3 凝血4项指标

与对照组小鼠相比，Sal高、低剂量组小鼠PT、APTT、TT及FIB差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 小鼠断尾出血时间

阳性药组、Sal低剂量组和Sal高剂量组小鼠断尾平均出血时间分别较对照组为长，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，但其余各组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.5 小鼠黑尾率及黑尾长度

造模12 h时，对照组小鼠黑尾率明显高于Sal高剂量组小鼠，差异有高度统计学意义(P<0.01)，

指标对照组(n=10)阳性药组(n=10)Sal低剂量组(n=10)Sal高剂量组(n=10)PT(s)12.22±0.5512.44±0.8912.37±0.6512.26±0.61APTT(s)22.60±1.3626.60±2.83(1)22.80±1.3322.79±1.28TT(s)18.99±1.0418.90±1.1019.10±1.0518.91±1.07FIB(g/L)1.76±0.141.73±0.161.77±0.171.82±0.17

注：(1)与对照组比较，P<0.01。

表4 各组小鼠断尾出血时间比较Tab.4 Effect of Sal on mice tail bleeding time

注：与对照组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

但阳性药组小鼠和Sal低剂量组小鼠间黑尾率比较差异无统计学意义(P>0.05)；造模24 h时，对照组小鼠黑尾率高于阳性药组和Sal高剂量组小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)；造模48 h时，各组小鼠间黑尾率差异均无统计学意义(P>0.05)。在造模12 h、24 h和48 h时，与对照组小鼠相比，阳性药组、Sal低剂量组和Sal高剂量组小鼠黑尾长度均有缩短，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，提示Sal有改善小鼠血栓形成的作用。见表5、图1。

表5 各组小鼠黑尾率及黑尾长度Tab.5 Effect of Sal on black tail rate and black tail length of mice

注：与对照组同时间比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

对照组 阳性药组 Sal低剂量组 Sal高剂量组图1 各组小鼠在角叉菜胶诱导48 h时黑尾长度Fig.1 Tail thrombosis length of different groups at 48 h after carrageenan induction

3 讨论

近年来，我国心血管疾病发病率持续升高，心血管疾病造成的死亡人数已居各类疾病死亡率的首位[14]。血栓性疾病在心血管疾病中比例很高，其中血小板功能异常导致的血栓形成和栓塞并发症是心血管疾病发病的主要原因[15]。抗血栓药物是防治血栓性疾病的重要手段，其中中药及其制剂对于抗血小板和抗血栓有着独到的疗效，且副作用小[16]。本研究结果显示，Sal对小鼠的体质量增长并无明显影响，对小鼠血细胞计数以及平均血小板体积均未产生明显影响。平均血小板体积可反应血小板体积以及体积的差异程度，该指标亦可体现血小板的产率及激活，相对于血小板计数，平均血小板体积更能反映血小板功能[17]。小鼠断尾出血是测定血小板功能的整体模型，包括血小板功能、血小板计数以及凝血系统在内的因素均可影响机体的止血功能[18]。同时，Sal对小鼠的凝血4项并无明显影响，则排除了小鼠凝血系统的影响。据此，本研究推测Sal可以延长小鼠出血时间，原因可能是通过抗血小板活性实现的。

角叉菜胶又名卡拉胶，是从红藻中提取的多糖物质的统称，属于较强的致炎物质，可用于复制炎症模型[19]。已有研究显示，皮下注射以及腹腔注射一定剂量的角叉菜胶可诱导小鼠尾部形成血栓[20]。此法复制的模型，血栓直观、肉眼可见，易于测量和观察，可用于抗血栓药物的评估[21-22]。参考文献多采用雄性小鼠进行造模，预实验观察到雌性小鼠经相同给药途径注射相同剂量的角叉菜胶后，其尾部血栓发生率以及血栓长度均低于雄性小鼠，故本研究亦采取了雄性小鼠进行实验。研究结果表明，Sal低、高剂量对延缓小鼠尾部血栓形成，减少尾部血栓长度均有作用，提示Sal对血栓形成具有明显的抑制作用。

综上所述，Sal对血栓形成具有明显的抑制作用，可能与其抗血小板功能活性有关，从而为Sal用于血栓性疾病的防治提供了理论基础。