响应面法优化月季花中总黄酮的提取工艺

钱慧琴，秦晶晶，李亚杰，刘林煜，闫福林，2，*

（1.新乡医学院三全学院，河南新乡453000；2.新乡医学院，河南新乡453000）

月季花（Rosac hinensisJacq.）属于蔷薇科（Rosaceae），蔷薇属（Rosa）常绿灌木[1]，因花期绵长，又称为“月月红”。花大艳丽，可作为庭院观赏植物，目前应用于化妆品和食品行业，作为精油提炼、制备香料、天然色素提取和食品加工的原料。花可入药，具有活血调经、消肿解毒、疏肝解郁之效，用于治疗月经不调，经来腹痛，跌打损伤，血瘀肿痛，痈疽肿毒等证[2]。经过大量试验研究表明，月季花含有多种化学成分，主要含有黄酮类、酚酸类、鞣质类、挥发油等成分[3-6]，其中，黄酮类化学物质在抗菌[7]、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]等方面显示较好的生物活性。目前，对于月季总黄酮的含量测定已经有相关报道[8]，但是针对月季花中总黄酮提取工艺的优化鲜有报道。本试验采用响应面法优化月季花中总黄酮的提取工艺，确定出最佳的提取工艺条件，旨在为月季花资源的开发利用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

月季叶：2018 年4 月采集于新乡医学院三全学院校园；芦丁对照品（批号：100080-201408）：中国食品药品检定研究院；乙醇、NaNO2等试剂均为分析纯：天津科密欧化学试剂有限公司。

电热鼓风恒温干燥箱（101-8）：江苏金坛市佳美仪器有限公司；新世纪紫外可见分光光度仪（T6）：北京普析通用仪器有限公司；数显恒温水浴锅（HH-S）：金坛市金南仪器厂；电子分析天平（HA2004）：上海象平仪器仪表有限公司；循环水式真空泵（SHZ-D II）：巩义市予华仪器有限责任公司；旋转蒸发仪（R206）：上海申生科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 月季花预处理

将采集的月季花洗净，用滤纸吸干，于60 ℃烘干，粉碎，过筛，将烘干样品放入广口瓶中，备用。

1.2.2 标准曲线的制备

精密配制质量浓度为0.1 mg/mL 的芦丁对照品溶液，精密吸取 0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40、2.80 mL的芦丁对照品溶液置于10 mL 容量瓶中，随后分别依次加入0.4 mL 5%亚硝酸钠，摇匀，放置6 min 后加入0.4 mL 10%硝酸铝，放置6 min，最后加入4 mL 4%NaOH 溶液，加蒸馏水定容，摇匀，放置15 min，用紫外-可见分光光度计于510 nm 处测定其的吸光度A510。以芦丁浓度C（μg/mL）为横坐标，吸收度A 为纵坐标绘制标准曲线，见图1。

图1 标准曲线Fig.1 The figure of standard curve

由图1 标准曲线得到回归方程为：y=0.011 3 x+0.018 4，相关系数R2=0.999 2。此方程具有良好的线性关系，可用于评价月季花总黄酮的质量浓度。

1.2.3 月季花中总黄酮的提取

精密称定月季花粗粉约1 g，置于100 mL 圆底烧瓶中，按一定的液料比例，加入不同浓度的乙醇溶液摇匀后，在一定的温度下进行加热回流提取一定时间，过滤至100 mL 圆底烧瓶中，于55 ℃减压浓缩至干，加水20 mL 悬浮，加石油醚洗涤3 次，弃去石油醚部分，水相再加乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯部分，水浴蒸干，加乙醇溶解后定量转移至100 mL 容量瓶中，乙醇稀释至刻度即得供试品溶液，待测。

1.2.4 月季花中总黄酮含量测定

精密吸取月季叶花供试品溶液1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，按“1.2.2”项下方法测吸光度。月季花中总黄酮质量浓度按照芦丁标准曲线回归方程进行计算。黄酮提取率计算公式如下：

式中：Y 为月季花中总黄酮提取率，mg/g；C 为月季花中总黄酮类化合物的质量浓度，mg/mL；m 为样品质量，mg。

1.2.5 单因素试验

按照“1.2.3”项下的方法分别考察乙醇体积分数（30%、50%、60%、70%、80%、95%）、提取温度（50、60、70、80、90 ℃）、液料比[15 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1（ mL/g）]、提取时间（30、60、80、100、120 min）4个因素对月季花中总黄酮提取率的影响。

1.2.6 响应面试验

根据单因素试验结果，确定响应面的优化范围，根据Box-Behnken 试验设计原理为依据，以乙醇体积分数（A）、提取温度（B）、液料比（C）、提取时间（D）为自变量，固定提取次数为1 次，总黄酮提取率为因变量，采用四因素三水平响应面优化工艺，利用统计分析软件Design expert 8.0.6 建立数学回归模型，确定月季叶总黄酮最佳提取工艺条件，试验设计因素水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 乙醇体积分数的影响

乙醇体积分数对月季花中总黄酮提取率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对月季花总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由图2 可知，月季花中总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增加而增加，当乙醇体积分数达到70%时，总黄酮提取率达到最大。当乙醇体积分数大于70%时，月季花总黄酮的提取率随着乙醇体积分数的增加而下降。这可能是因为当乙醇体积分数达到70%时，黄酮类物质溶出趋于饱和，随着乙醇体积分数的增加，其他醇溶性物质溶出也增多，使得黄酮提取率反而下降。所以，确定最佳乙醇体积分数为70%。因此，在响应面试验中，选择60%、70%、80%3 个水平进行响应面优化。

2.1.2 提取温度的影响

提取温度对月季花总黄酮提取率的影响见图3。

图3 提取温度对月季花总黄酮提取率的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由图3 可知，随着提取温度的升高，月季花总黄酮的提取率随之增加。当温度达到80 ℃时总黄酮提取率达到最高，之后迅速降低。可能是因为当温度较低时，总黄酮得不到充分的提取，但是过高的温度又会导致黄酮类物质化学结构发生变化，转变成非黄酮类成分，其他醇溶性物质随着温度升高溶出增加，最终导致总黄酮提取率迅速降低。所以，确定最佳提取温度为 80 ℃。因此，在响应面试验中，选择 70、80、90 ℃3 个水平进行响应面优化。

2.1.3 液料比的影响

料液比对月季花总黄酮提取率的影响见图4。

图4 液料比对月季花总黄酮提取率的影响Fig.4 Effects of liquid-to-solid ratio on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由图4 可知，在液料比 15 ∶1（mL/g）～50 ∶1（mL/g）内，月季花总黄酮提取率随液料比的增大而增加。当液料比大于50 ∶1（mL/g）时，总黄酮提取率反而下降。这可能是因为增加提取溶剂与原料的比例，有利于黄酮类物质的溶出，但是，当液料比达到50 ∶1（mL/g）时，黄酮类物质的溶出达到饱和，继续增加液料比，会使其他杂质的溶出增多，同时会增加后续提取液的浓缩时间。所以，确定最佳液料比为 50 ∶1（mL/g），因此，在响应面试验中，选择液料比例为 40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1（mL/g）3 个水平进行响应面优化。

2.1.4 提取时间的影响

提取时间对月季花总黄酮提取率的影响见图5。

图5 提取时间对月季花总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由图5 可知，在提取时间 50 min～100 min 范围内，月季花总黄酮提取率明显增加，当提取时间超过100 min时，随着提取时间增加总黄酮提取率反而下降，这可能是因为提取时间过短黄酮类化学物质溶解不充分，不能有效提取出来，但是提取时间过长导致黄酮类物质化学结构遭到破坏，导致总黄酮提取率降低。所以，确定最佳提取时间为100 min。因此，在响应面试验中，选择提取时间80、100、120 min 3 个水平进行响应面优化。

2.2 响应面法优化月季花总黄酮提取工艺

2.2.1 响应面试验设计结果

在单因素试验基础上，选用响应面分析法对月季花总黄酮的提取工艺条件进行优化。试验方案设计及结果见表2。

表2 响应面优化试验设计与结果Table 2 Experimental design with experimental values of flavonoid yield for response surface analysis

2.2.2 多元二次响应面回归模型的建立及显著性分析

利用Design-Expert 8.0.6 软件对试验结果进行多元回归分析，得到拟合全变量二次回归方程：Y=12.53-0.69A+1.61B+0.83C-1.02D+0.21AB+0.79AC+0.52AD+0.23BC-2.04BD+0.27CD+1.74A2+1.08B2+0.92C2+1.06D2（R2=0.966 7），响应面多元二次模型方差分析结果见表3。

表3 响应面二次模型方差分析Table 3 The response surface quadratic model analysis of variance

续表3 响应面二次模型方差分析Continue table 3 The response surface quadratic model analysis of variance

由表3 可知，模型的 F=29.05，P＜0.000 1，表明该模型极显著；失拟项P=0.054 4＞0.05，说明失拟项不显著；该模型相关系数 R2=0.966 7 和调整系数R2Adj=0.933 4，说明93.347%响应值的变化是由独立变量决定，只有6.66%的总变异系数不能由该模型来解释，模型的变异系数为3.51%，在可接受的范围内，说明该试验值有较高的精密度及可靠性。综上所述，可以通过该方程来预测月季花总黄酮的最佳提取工艺。一次项影响因素A、B、C、D 有显著影响，根据F 值的大小，得出对月季花中总黄酮提取率各因素的影响依次是：提取温度（B）＞提取时间（D）＞液料比（C）＞乙醇体积分数（A）。交互项中，AC、BD 有显著影响，说明乙醇体积分数和液料比、提取温度和提取时间的交互作用对月季花总黄酮提取率有显著影响；二次项中A2、B2、C2、D2都有极显著影响，说明各因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是存在一定交互作用。

2.2.3 响应面优化

应用Design-Expert 8.0.6 软件拟合绘制三维响应曲面图及相应的等高线图见图6～图11。

图6 乙醇体积分数与提取温度的响应曲线Fig.6 Response surface methodology analysis for interactive effects of alcohol concentration and extraction temperature

图7 乙醇体积分数与液料比的响应曲线Fig.7 Response surface methodology analysis for interactive effects of alcohol concentration and solvent-to-solid ratio

图8 乙醇体积分数与提取时间的响应曲线Fig.8 Response surface methodology analysis for interactive effects of alcohol concentration and extraction time

响应面图坡度的陡峭程度直观地反映了各因素对响应值的影响，响应面坡度陡峭，说明两因素交互作用明显，反之，响应面坡度平缓，说明两因素交互作用不明显。等高线的形状也可以反映各因素的交互影响是否显著，若等高线为圆形，则表明两变量之间的交互影响不显著；若为椭圆形，则表明两变量之间的交互影响显著[9-10]。图7、图10 表现出响应面陡峭，等高线呈现椭圆形，说明乙醇体积分数与液料比、提取温度与提取时间交互作用对月季花总黄酮提取率的影响显著；图6、图8、图9、图11 表现出响应面平缓，等高线呈现近圆形，说明乙醇体积分数与提取温度、乙醇体积分数与提取时间、提取温度与液料比、液料比与提取时间交互作用对月季花总黄酮提取率的影响不显著。这与响应面显著性分析结果一致。

2.2.4 最优工艺及验证试验

图9 提取温度与液料比的响应曲线Fig.9 Response surface methodology analysis for interactive effects of extraction temperature and solvent-to-solid ratio

图10 提取温度与提取时间的响应曲线Fig.10 Response surface methodology analysis for interactive effects of extraction temperature and extraction time

图11 液料比与提取时间的响应曲线Fig.11 Response surface methodology analysis for interactive effects of solvent-to-solid ratio and extraction time

利用Design-Expert 8.0.6 软件进行优化，对回归模型求解方程，得出月季花总黄酮最佳提取工艺为：乙醇体积分数60.48%，提取温度86.97 ℃，液料比42.02 ∶1（mL/g），提取时间 85.56 min，此条件下月季花总黄酮提取率最高，预测值为19.492 mg/g。为了验证模型的有效性，并结合实际情况将最佳提取工艺条件改为乙醇体积分数60 %、提取温度87 ℃、液料比42 ∶1（mL/g）、提取时间 85 min，在此工艺条件下，月季花总黄酮提取率为19.15 mg/g，与模型预测值基本吻合，说明所得模型可以用来预测月季花中总黄酮提取率，对提取工艺条件参数优化可靠可行。

3 结论

在单因素试验的基础上，采用响应面法对月季花总黄酮提取工艺条件进行优化，通过Box-Behnken 设计试验，运用Design-Expert 8.0.6 软件对试验结果进行多元回归分析，建立月季花总黄酮提取工艺的二次多项式回归模型，以及各个因素之间的交互作用对月季花中总黄酮得率的影响，确定最佳提取工艺。根据实际操作条件，将月季花总黄酮得率的最佳提取工艺修正为乙醇体积分数60 %、提取温度87 ℃、液料比42 ∶1（mL/g）、提取时间 85 min，为月季花资源的开发、综合利用及其质量控制提供理论依据。