顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法分析欧李果实挥发性成分

李晓颍，王海静，徐宁伟，曹翠玲，刘建珍，武春成，张立彬

顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法分析欧李果实挥发性成分

李晓颍1，王海静1，徐宁伟1，曹翠玲2，刘建珍1，武春成1，张立彬1

（1河北科技师范学院园艺科技学院，河北秦皇岛 066600；2秦皇岛出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北秦皇岛 066004）

【】优化前处理影响因素，分析欧李果实挥发性成分，明确挥发性成分特点并对果实特征性香气成分进行评价。以欧李果实为试材，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法（HS-SPME-GC-MS）测定其挥发物成分，通过优化前处理影响因素，确定最佳试验条件。利用解卷积系统（AMDIS）与NIST11质谱数据库以及保留指数（RI）对其挥发性成分进行鉴定，内标法确定挥发物含量，并计算香气强度值（OAVs），评价欧李果实香气品质与特征。在欧李果实中累计鉴定出63种挥发物，含量范围为0.01—3.25 µg·kg-1。挥发物以酯类、烷类为主，并有少数醇类、芳香类、醛类、萜类、酸类、酮类，其中苯甲酸乙酯含量最高。通过参考相关挥发物香气阈值并计算部分挥发物OAVs可知，己酸乙酯、乙酸苯乙酯、β-芳樟醇、乙酸己酯、壬醛等物质对欧李果实香气成分构成具有重要作用，而烷烃不具有特征性香气。欧李果实香气主要为青香、花香、果香、脂蜡香和其他少数香型（木香型、芳香油香型等），并以青香、花香、果香型物质为主，三者总含量达到挥发物总量的80%。优化确立的试验条件为：果肉去核切碎处理，取样量5 g，萃取温度50℃，萃取时间与平衡时间均为30 min。SPME前处理条件对果实挥发性成分检测到的种类与含量有较大影响，通过优化试验条件可以获得最佳检测结果。欧李果实挥发物组成复杂，除烃类物质香气品质较弱外，多数具有特征香气，且香气强度属中高级，酯类物质是欧李果实的重要挥发物组成，清香型、花香型和果香型是欧李果实香气成分的主要特点。

欧李；挥发性成分；条件优化；香气强度值；香气品质

0 引言

【研究意义】欧李[(Bge.) Sok]是一种矮小、丛生的灌木型蔷薇科植物，其根冠比大，具有耐旱、耐寒、耐盐碱的特点，广泛分布于我国北方干旱、寒冷地区，是我国北方特有树种[1]。欧李果实形似樱桃，酸甜可口，风味独特，是天然补钙、铁的水果，是深加工的适宜原料[2-4]。作为一种高营养、高保健的第三代果树，现已选育出一系列新品种，株产0.3—1.5 kg[5-6]。随着消费者对果实品质要求不断提高，有关香气品质的研究也日益受到重视。香气作为果品加工和鲜食的主要因素，不仅反映果实的风味特点和成熟度，而且是评价果实商品品质的重要指标。开展欧李果实香气品质的研究，对于进一步了解欧李果实特点和品质开发具有重要意义。【前人研究进展】欧李果实香气成分研究工作已逐渐开展，Ye等[7]评价了30份欧李种质资源挥发性成分之间的差异，累计鉴定出85种成分，不同品种间挥发物种类与含量有较大差别，其中，红果香气含量最高，紫果香气含量最低，依据挥发物的主成分分析将30份资源分为4个群组。刘俊英等[8]研究了成熟度对欧李果实香气成分的影响，表明随着成熟度增加，醇类、醛类、酸类、萜烯类相对含量增加，脂类相对含量降低。周立华等[9]研究了冷冻对欧李香气的影响，结果表明，冷冻前后挥发物数量变化不大，冷冻对欧李果实加工特性的影响不明显，反而有助于增加果实的成熟香气。此外还有基于不同提取方法与固相微萃取（SPME）条件所进行的欧李香气分析方法优化的研究[10-11]。此外，相关研究表明[12-14]，对测定结果进行谱库检索以及RI分析是对挥发物进行鉴定的有效手段。通过参考香气阈值、香气品质，则可对香气特征进行描述[15]。【本研究切入点】SPME是目前广泛应用的挥发性成分萃取方法[16]，其萃取效果受萃取头类型、萃取温度、萃取时间、盐离子浓度和平衡时间等因素的影响，通过优化条件可以明显改善试验效果[17]。本试验以我国特有树种欧李果实为试材，在优化SPME萃取影响因素的基础上，采用AMDIS软件、NIST11数据库以及RI对其挥发性成分进行鉴定，内标法确定挥发物含量，并通过OAVs以及香气品质对欧李果实香气成分进行评价，对特征性香气物质及其系列分布进行预测。【拟解决的关键问题】旨在优化并建立有效、准确的欧李果实挥发性成分分析鉴定方法，对欧李果实主要香气成分及其特征进行评价，为欧李风味物质研究与开发利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

试验于2018年7—9月在河北省昌黎县河北科技师范学院园艺科技学院中心实验室进行。

1.1 材料准备

欧李品种为‘燕山1号’，土壤为褐土，肥力中等。试验采摘健康无病害的成熟果实，分别装入塑料袋封好，立刻带回实验室进行试验。其中，切碎处理是将完整欧李果实去核后均匀切碎，充分混匀后取样；榨汁处理是将上述样品挤压，纱布过滤，取果汁；匀浆处理是将切碎处理的样品进行高速均质破碎，取果浆。处理后的样品均需迅速置于20 mL顶空瓶中，封口。每个样品重复3次。

1.2 仪器与试剂

50/30 μm DVB/CAR/PDMS自动固相微萃取头购自美国Supelco公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪（配有PAL自动进样系统、自动质谱解卷积鉴定系统，NIST11质谱库）购自美国Agilent公司。

3-辛醇（纯度≥98.5%）与正构烷烃混合标准品（C6—C30，1 000 mg·L-1），均购自美国Sigma-Aldrich公司；正己烷为色谱纯，购自瑞典Oceanpak公司。

1.3 条件与方法

1.3.1 GC-MS条件 GC条件：HP-5 MS石英弹性毛细管柱（30.0 m×320 μm×0.25 μm），载气为He（99.999%），不分流进样，流量1.0 mL·min-1，进样口温度230℃，起始温度为40℃，保持5 min，以2℃∙min-1升至70℃，保持2 min，再以5℃∙min-1升至120℃，保持2 min，再以10℃∙min-1升至230℃，保持5 min。

MS条件：EI源电压70 eV，离子源温度为230℃，接口温度250℃，四级杆温度150℃，质量扫描范围为50—550。

1.3.2 SPME条件 在试验开始前对固相微萃取纤维头进行老化处理，以消除干扰杂质的影响，老化条件严格按照仪器说明书进行，将固相微萃取纤维头插入GC-MS进样口中，并在250℃条件下，老化5 min。若该萃取纤维头首次使用老化条件则要延长到30 min。按试验要求对自动进样器的加热温度、平衡时间、萃取时间进行设定，振摇速度为250 r/min，解吸时间为5 min。

1.4 数据分析

1.4.1 挥发物定性与定量 内标配制：以3-辛醇为内标物用正己烷稀释105倍后，取1.0 μL按上述GC-MS条件进行测定。

保留指数值（RI）测定：将正构烷烃混标稀释102倍后，取1.0 μL按上述GC-MS条件测定，通过AMDIS软件建立保留指数校正库（RI calibration library），并用于挥发物保留指数RI值测定，RI计算公式如下：

其中，Z是未知组分峰的前一个相邻正构烷烃所含碳原子数目，RTx、RTz、RTz+1分别表示未知组分以及碳数为Z、Z+1的正构烷烃的保留时间。

定性分析：利用GC-MS联用仪工作站所关联的自动解卷积系统（AMDIS）与NIST11质谱库结合化合物保留指数值（RI）对挥发物进行鉴定。

定量分析：根据内标含量和挥发物的色谱峰面积与内标的色谱峰面积进行比较，计算挥发物相对于内标的含量，计算公式如下[18]：

其中，ωx是未知挥发物的浓度（µg·kg-1），nis是内标物质的量（g·mol-1），Mx是内标物的摩尔质量，Ax是未知化合物的峰面积，Ais是内标物的峰面积，m0是样品取样量（g）。

1.4.2 香气强度值（Odor-activity values, OAVs）的计算 根据文献提供的挥发性物香气阈值（Odor threshold），计算香气强度值，计算公式如下：

其中，Tx是未知挥发物的香气阈值（µg·kg-1）。

1.4.3 统计分析 试验数据采用Microsoft Excel 2016软件处理，DPS 7.05软件进行差异显著性分析。

2 结果

2.1 前处理条件单因素优化

2.1.1 样品处理与加盐量 试验首先对比欧李果肉去核切碎处理与榨汁处理两种条件下检测到的挥发物情况，两种条件下分别检出挥发物59与50种，峰面积分别为54.00×107与67.62×107，综合挥发物种类与峰面积情况，选择果肉去核切碎处理最大程度保持了样品的原有挥发性成分，且操作简单，便于分析。

试验进一步分析了不同加盐量（0、0.5、1.0、1.5 g）在匀浆处理后的挥发物萃取情况（图1）。试验表明，当添加1.0 g NaCl后检出挥发物种类最多为47种，峰面积总量随加盐量的增加逐渐升高，添加1.5 g NaCl时峰面积总量为9.40×106，不加盐情况下检测到的挥发物种类和总量均少于加盐条件，这表明加盐可以提高对目标物的萃取效率，但由于萃取到的挥发物种类和总量均远少于前述果肉去核切碎处理，可见，挥发物在加盐均质破碎过程中会有很大损失。因此，采用加盐均质破碎的方法在本次试验中不宜采用。

通过对样品处理方法的优化，最终选择果肉切碎处理，不仅样品处理简单，还能降低挥发物损失，因此，后续试验过程中均采用果肉去核切碎处理。

2.1.2 取样量 取样量与挥发物检出情况（图2）表明，随着取样量的增加，检出挥发物种类呈先增后减的趋势，取样量为5 g时达到最大值57种；峰面积总量在取样量范围内变化不明显，取样量为5 g时为最大值42.52×107。上述结果表明，随着取样量的增加，含量较低的挥发物逐渐被萃取，检出的挥发物种类增加；此外，取样量范围内萃取头吸附均接近饱和，取样量增加到一定程度（＞5 g），分析物之间竞争作用加强，反而不利于挥发物的萃取，同时也会造成样品的浪费。综合考虑，选择样品用量为5 g较为合适。

同一曲线中标有不同小写字母分别表示组间差异显著（P＜0.05）。下同

图2 取样量对挥发物萃取情况的影响

2.1.3 萃取温度 萃取过程中温度的升高可以加大分析物的扩散系数，从而增加分析物向涂层纤维的传质速率。由图3可知，随着萃取温度的升高，挥发物种类呈逐渐升高的趋势，其中30—50℃之间变化在正常范围内，但当萃取温度高于50℃时，挥发物种类与峰面积均急剧增加，萃取温度为60、70℃时增加的挥发物中有相当数量的氧化产物，可见，当萃取温度高于50℃时，样品开始发生变质，对测定结果造成影响。由试验结果看，选择萃取温度50℃进行试验更为合理。

图3 萃取温度对挥发物萃取情况的影响

2.1.4 萃取时间 萃取时间与香气检出情况的关系（图4）可知，在萃取时间范围内，挥发物检出种类与峰面积总量随萃取时间的增加大致呈先升后降再上升的趋势。说明随着萃取时间的增加，检出香气物质增多，峰面积总量增加，直至萃取头吸附达到饱和；继续增加萃取时间，原来吸附在萃取头上的目标物则会重新解析出来，从而造成萃取量的降低，目标物在萃取头上的吸附与解析呈动态变化的过程。萃取时间30 min是第一个平衡的最大值，继续增加萃取时间无益，因此，选择30 min萃取时间为宜。

图4 萃取时间挥发物萃取情况的影响

2.1.5 平衡时间 平衡时间与挥发物检出情况（图5）可知，挥发物种类在平衡时间内主要呈先升高后平衡的趋势，这表明一定的平衡时间可使更多的挥发物从样品中释放出来，平衡40 min时检出最多为67种；由挥发物总量的变化情况可知，主要挥发物的释放在10 min内就可以完成，由于目标物在两相中的竞争作用，增加平衡时间，挥发物会重新溶解在样品中，导致挥发物总量的下降，平衡时间内挥发物的释放与溶解同样呈现动态平衡过程，其中10、30、50 min时挥发物的释放程度最大，峰面积总量为1.30×108左右。因此，选择平衡时间为30 min即可保证分析要求也可缩短试验时间。

图5 平衡时间对香气检出情况的影响

2.2 挥发性成分与含量

按优化的方法，对欧李果实挥发性成分进行测定，总离子流色谱图如图6所示。

图6 欧李果实挥发性成分总离子流图

由欧李果实挥发物种类与含量（表1）可知，本试验鉴定出各类挥发物共63种，含量范围为0.01—3.25 µg·kg-1，其中含量较高的挥发物有苯甲酸乙酯（3.25 µg·kg-1）、十五烷（1.31 µg·kg-1）、乙酸苯乙酯（1.16 µg·kg-1）、4,11-二甲基-十四烷（0.85 µg·kg-1）、(Z)-3-辛酸己烯酯（0.78 µg·kg-1）、乙酸己酯（0.66 µg·kg-1）、十三烷（0.61 µg·kg-1）、辛酸己酯（0.54 µg·kg-1）。

2.3 挥发物类型与含量

挥发性成分主要为酯、烷、醇、芳香类、醛、萜类、酸、酮8类（表1）。其中酯类数量最多，为30种，占累计检出化合物的47.6%；其次为烷烃19种，占累计检出化合物的30.1%；其他几类检出数量均较少（醇5种、芳香类3种、醛2种、萜类2种、酸1种、酮1种）。由不同类型挥发物累计含量可知，酯类最高，为9.69 µg·kg-1，占总挥发物含量的59.1%；其次为烷类5.38 µg·kg-1，占总挥发物含量的32.8%；其他几类累计含量均较低（＜0.5 µg·kg-1），由此可见酯类和烷类是欧李果实主要挥发性成分。

表1 欧李果实挥发性成分及其含量

Cal.：挥发物在本次色谱条件下测定的保留指数；Ref.：参考NIST Chemistry WebBook, SRD 69中HP-5ms上的保留指数

Cal.: The retention index calculated on HP-5ms column against n-alkanes (C6-C30) in this experiment; Ref.: The reference retention index shows in NIST Chemistry WebBook on HP-5ms column

2.4 香气强度与品质

除烷烃不具有明显香气特征，(Z)-庚酸-3-己烯酯和(E)-3-甲基-4-癸烯酸的香气特征未见报道外，试验对剩余42种挥发物（含酯、醇、芳香烃、醛、萜类、酮）的香气强度与品质进行了分析（表2）。其中可参考香气阈值物质为19种，通过计算可知OAV较高的物质（＞0.1）为己酸乙酯（10.87）、乙酸苯乙酯（4.63）、β-芳樟醇（0.48）、乙酸己酯（0.33）、壬醛（0.17），这些物质对欧李果实香气成分构成具有重要作用。通过香气强度分级情况可知，属高等香气品质的物质为9种，中等32种，低等香气品质的物质仅1种，其中壬醛、苯甲醛、苯甲酸甲酯、萘、乙酸乙酯、异丁酸叶醇酯、(Z)-3-己烯-1-醇、乙酸叶醇酯、己酸乙酯为高等香气品质物质，软脂酸乙酯为低等香气品质物质，其他均为中等香气品质。

香气品质分析可知，欧李果实香气主要为果香、花香、青香、脂蜡香和其他少数香型（木香型、芳香油香型等），其中果香型10种、花香型10种、青香型11种、脂蜡香型6种和其他香型5种。按照各种香气物质在感官特征方面所表现出的香气类型，进行分类分析，具有同种香气类型物质的含量进行加和，作网状图（图7），由挥发物含量可知主要香气品质的强度分别为：青香型（5.86）、花香型（2.06）、果香型（1.16）、脂蜡香型（0.84）、木香型（0.1）、其他香型（0.78）。青香型物质占有重要比重，果香与花香型占有一定比重，三者达到了香气物质含量的80%，可见，欧李果实香气成分以青香、花香、果香型物质为主。脂蜡香型物质多见于果酒香气中[34]。

图7 欧李果实香气系列分布

3 讨论

用于果实香气测定的样品处理主要有榨汁、果肉匀浆加盐、果肉切碎[4]等处理。对于含水量较高的果实，可选择榨汁的方式处理样品，操作简单，亦可满足分析，如葡萄果实[35]。研究表明，加盐可以提高挥发物的萃取效率，盐析作用所形成的水合球可降低挥发物分子的溶解浓度，促使多余的分析物进入萃取头。挥发物分子也可能与溶液中的盐离子发生静电作用，降低其进入纤维涂层的能力。但加盐多适用于果汁、果酒类液体样品[10]或浆果类样品[36-38]分析。本研究表明，随加盐量增加，挥发物萃取总量逐渐升高，说明盐析作用可以促进挥发物的释放，但所得挥发物种类和总量明显低于果肉切碎处理，可能是匀浆和其他操作易造成挥发物损失，榨汁处理同样会造成挥发物损失，而果肉切碎处理，不仅样品处理简单，也降低了挥发物损失，最大程度保留了样品的原有成分。此外，SPME的萃取效果受萃取温度、时间、平衡时间等因素的影响，通过优化条件可以明显改善试验效果[17]。本次试验采用单因素试验，以检出挥发物种类与峰面积总量为响应值，分别对样品量、萃取温度、萃取时间、平衡时间等影响因素进行了优化。试验表明，增加样品量可以提高挥发物检出数量，取样量持续增加，分析物之间竞争作用加强，反而不利于挥发物的萃取，峰面积总量表明在取样量范围内萃取头吸附均已接近饱和，变化不明显；萃取温度变化表明提高温度可以增加分析物的扩散系数，增加萃取效率，但50—60℃是样品发生变质的关键温度，萃取温度设定不宜高于50℃；萃取时间变化趋势表明萃取头所吸附的被检挥发物有脱落和再吸附的动态过程；平衡时间的变化趋势表明被检挥发物有释放与溶解呈现动态过程。

本次在欧李果实中检测到63种挥发物，明显高于Ye等[7]、刘俊英等[8]所检测得的挥发物数量，与周立华等[9]报道所鉴定的挥发物种类接近，但本次试验所采用的定性、定量方法更准确。挥发物含量（0.01—3.25 µg·kg-1）与Ye等[7]所报道的接近，含酯、烷烃、醇、芳香类、醛、萜类、酸、酮等。挥发物种类及含量表明其挥发物组成复杂，其中酯类和烷类是欧李果实主要挥发性成分，与报道一致[7]；但本次试验未检测到内酯类化合物，可能与样品或处理方式有关。

表2 欧李果实挥发性成分香气强度与品质

在欧李果实挥发性成分中，烷烃是仅次于酯类的第二大挥发物来源，烷烃主要来源于植物表皮所覆盖的蜡质[39]，蜡质具有多种功能，可以为植物提供物理化学保护屏障，减少非气孔水分的损失，控制温度，提供光保护，增强抗霜冻能力以及对有害物（包括害虫、真菌和细菌）攻击的抵抗力[40-41]，烷类挥发物多不具有特定气味，香气贡献度低。关于(Z)-庚酸-3-己烯酯和(E)-3-甲基-4-癸烯酸的香气特征未见报道，其他挥发物则不同程度具有特征性香气。

OAVs是评价香气化合物重要性的一个指标，能更好的衡量一个香气物质对香气的贡献度。挥发物的OAV值大于或者等于1时对样品香气组成有贡献，OAV值越大，对香气贡献越大[25-30]。欧李香气OAVs表明乙酸苯乙酯、β-芳樟醇、乙酸己酯、壬醛、己酸乙酯、乙酸乙酯以及苯甲酸乙酯7种挥发性物质成分对欧李果实特征性香气的构成具有重要作用。香气系列分布表明青香型物质占有重要比重，果香与花香型物质所占比重接近，是欧李主要香气特征，与实际嗅感一致。

相关研究表明，组成欧李香气成分除用作香精香料使用外，还具有一定生物活性，如乙酸苯乙酯与苯乙醇具有高效的抗菌活性[42]，β-芳樟醇具有抗氧化作用[43]，这可能是欧李作为古老的果药兼用树种的原因。此外，壬醛、2-壬酮对昆虫具有驱避作用[44]，乙酸叶醇酯对昆虫具有引诱作用[45]，这是欧李具有抗病虫害、抗逆性强等特性[3]的原因，对欧李适应自然环境，抵御各种危害具有重要作用。

4 结论

优化的欧李果实挥发性物质萃取条件为：果肉去核切碎处理，取样量5 g，萃取温度50℃，萃取时间与平衡时间均为30 min。鉴定欧李果实挥发物63种，酯类和烷类是欧李果实主要挥发性成分，除烷类物质其他挥发物多具有特征香气，青香、果香、花香是欧李香气主要特征，这些物质共同构成了欧李果实的独特香气。

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Analysis of Volatile Components in(Bge.) Sok by Headspace Solid Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry

LI XiaoYing1, WANG HaiJing1, XU NingWei1, CAO CuiLing2, LIU JianZhen1, WU ChunCheng1, ZHANG LiBin1

(1College of Horticulture Science & Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao 066600, Hebei;2Inspection and Quarantine Technique Centre, Qinhuangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qinhuangdao 066004, Hebei)

【】The objective of this study was tooptimize thepretreatment conditionsand to analyze the volatiles of(Bge.) Sok, further to evaluate the characteristics of the main aroma components.【】The fruit of(Bge.) Sok was used as material, the volatiles were determined by headspace solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS), and the pretreatment conditions were optimized. Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System (AMDIS), NIST11 database and retention index (RI) were applied to volatiles identify, internal standard to contents calculate, final the odor-activity values (OAVs) and aroma qualities were evaluated.【】Total of 63 volatiles were identified,namely main of esters and alkanes, few of alcohols, arenes, aldehydes, terpenes, acid and ketone, with ranges from 0.01 to 3.25 µg·kg-1, in which ethyl benzoate as the highest. The OAVs showed ethyl hexanoate,phenethyl acetate,β-linalool,hexyl acetate,and nonanal were the main aroma components, alkanes almost the odorless. Green, fruity,floral,waxy and less woody and oily aromatic formed the odor qualities, while the former three performed the main odors reached 80% content. 【】The conditions were optimized as follows: samples loading for 5 g after cored and chipping, extraction temperature was 50℃, and both extraction and balance time was 30 min. The pretreatment had great influence on the volatiles detection, and preferable results would be yield by optimizing conditions. Results showed esters were the main components, except alkanes, and the most of them had aroma characteristics, presented medium or high strength, while green, fruity, floral were the major odor types.

(Bge.) Sok; volatile components; optimization analysis; odor-activity values (OAVs); aroma quality

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.19.014

2019-03-27；

2019-08-21

河北省科技计划项目（15236802D）

李晓颍，E-mail：xiaoyingli_run@163.com。

张立彬，E-mail：13603232069@163.com

（责任编辑 赵伶俐）