罗丹明席夫碱荧光探针的合成及在Cu2+和Fe3+检测中的应用

郭振丽，杨 杨，刘景林，许 良

（内蒙古民族大学 化学化工学院 内蒙古自治区天然产物化学及功能分子合成重点实验室，内蒙古 通辽 028000）

Fe 和Cu 是构成蛋白、细胞色素和多种酶的基本元素，在新陈代谢中起着重要的作用［1］。这些离子的失衡会对人体健康造成很大的威胁，可导致各种严重的病变。Cu 的摄取异常会导致代谢紊乱和神经退行性疾病，如威尔逊病、帕金森病、阿尔茨海默症以及门克斯综合症［2］。Fe 的缺乏会引起贫血、肝肾损害、心力衰竭和糖尿病等；而Fe 含量超标会导致组织炎症、多器官的损伤［3］。虽然现代仪器分析手段可以很成熟地检测环境中的金属离子，但由于试样处理步骤复杂繁琐，不利于生物试样中金属离子的实时检测。荧光探针技术以其简便、高效的特点在离子检测中具有明显的优势，而根据罗丹明母体设计的离子型荧光探针分子在化学分析和生命科学领域得到广泛应用［4-6］。本课题组曾设计合成了多种罗丹明类荧光探针分子，实现了对Fe3+，Cu2+，Hg2+的高灵敏度识别和荧光响应［7-8］。

本工作将罗丹明酰肼与对溴苯甲醛进行缩合反应，得到罗丹明席夫碱探针分子（RBr），通过单晶衍射和核磁共振波谱对它的结构进行了表征，在体积比为1∶1 的乙腈/水溶液中，RBr 对Cu2+和Fe3+显示出较强的吸收和荧光识别特性。

1 实验部分

1.1 主要试剂

罗丹明B、金属硝酸盐（Fe3+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Cd2+，Hg2+，Pb2+，Ag+）、硫酸亚铁铵：分析纯，天津天力化学试剂公司；对溴苯甲醛：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；80%（w）水合肼溶液：上海萨恩化学技术有限公司；乙腈：色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司；实验用水为蒸馏水：北京屈臣氏食品饮料公司。罗丹明酰肼按照文献［9］的方法合成。

1.2 主要仪器

BRUKER AV-500M 型核磁共振波谱仪、BRUKER Smart CCD Apex-Ⅱ型单晶X 射线衍射仪：德国布鲁克公司；SHIMADZU IRTracer-100型红外光谱仪：日本岛津公司；JASCO FP-6500型荧光分光光度计：日本佳司科公司；普析TU-1901 型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；2F-20D 型暗箱式紫外分析仪：巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 RBr 的合成与表征

称取罗丹明酰肼（0.684 0 g，1.5 mmol）和对溴苯甲醛（0.277 5 g，1.5 mmol），溶解于50 mL 无水乙醇中，加热回流12 h。反应结束后，冷却至室温，将反应液倒入饱和食盐水中，经二氯甲烷萃取、干燥、浓缩后，用石油醚/乙酸乙酯柱层析分离提纯，得到白色粉末状的固体RBr，产率为74%。合成路线见式（1）。1H NMR（500 MHz，CDCl3）：δ为8.69（s，1H），8.01（d，J=7.1 Hz，1H），7.60～7.46（m，2H），7.45～7.34（m，4H），7.15（d，J=7.2 Hz，1H），6.53（d，J=8.8 Hz，2H），6.46（d，J=2.0 Hz，2H），6.26（d，J=8.8，1.9 Hz，2H），3.34（q，J=7.0 Hz，8H），1.17（t，J=7.0 Hz，12H）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）：δ为164.96，153.20，151.59，148.93，145.93，134.43，133.42，131.44，129.38，128.86，128.34，128.01，123.93，123.70，123.38，107.97，106.01，97.83，66.12，44.32，12.61。IR（KBr）：ν=2 966，1 701，1 616，1 514，1 427，1 309，1 220，1 120，1 008，817 cm-1。单晶X 射线衍射经验分子式：C35H35BrN4O2。

2 结果与讨论

2.1 RBr 溶液的配制及测试条件

称取RBr 0.006 g，用乙腈配制成1×10-3moL/L 的储备液。测试前再将储备液用乙腈/水（体积比为1∶1）溶液稀释为1×10-5mol/L。分别配制1×10-2mol/L 的Fe2+，Fe3+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Cd2+，Hg2+，Pb2+，Ag+待测溶液。为确定RBr 与Cu2+和Fe3+结合的最佳检测时间，进行了光谱时间扫描，发现RBr 溶液在15 min 后光谱强度基本不变。因此，选择性和滴定测试均在混合15 min 后进行。

2.2 RBr 对离子的选择性

RBr 加入不同离子后的吸收和荧光光谱变化见图1。由图1 可知，在RBr 溶液中分别加入上述待测金属离子后，RBr 分子对大部分离子无识别，吸收光谱或荧光发射变化不明显。当加入Cu2+后RBr 溶液由无色变为紫色，560 nm 处出现最大吸收峰；而加入Fe3+后探针溶液变为粉红色，紫外光激发下溶液出现红色荧光。RBr 溶液的最大吸收峰为565 nm，荧光发射峰为578 nm，其他离子加入受均无明显变化。

为了考察RBr 在复杂条件下对Cu2+和Fe3+的识别能力，加入干扰离子和待测Cu2+和Fe3+前后，测定多种离子共存时的光谱强度变化，结果见图2。由图2a 可知，在共存离子中加入Cu2+后，探针的最大吸收峰强度迅速增强，说明其他共存离子对Cu2+的识别干扰较小。由图2b 可知，加入Fe3+前后，探针溶液的荧光发射强度均增强，尤其是Fe3+与Hg2+共存时，荧光强度为单独加入Fe3+时强度的2 倍，这说明探针对Fe3+荧光选择性较高。

图1 RBr 加入不同离子后的吸收光谱（a）、荧光光谱（b）和溶液颜色（c）变化Fig.1 Absorption(a)，fluorescence(b) and color(c) changes of RBr added with various cations.

图2 RBr 中加入Cu2+（a）或Fe3+（b）及共存离子的光谱变化Fig.2 Spectral changes of RBr added with Cu2+(a)，Fe3+(b) and co-existing ions.

2.3 RBr 光谱滴定实验

为了研究RBr与Cu2+或Fe3+结合的动力学过程，进行了吸光度滴定和荧光滴定实验。RBr 与Cu2+或Fe3+的滴定关系见图3。由图3a 可知，随着Cu2+浓度的增大，探针在559 nm 处的吸收强度增强，当溶液中Cu2+浓度达到8.2×10-6mol/L 时，吸收强度达到峰值。Cu2+浓度为1×10-6～8.2×10-6mol/L时，与吸收强度呈线性关系（y=0.006 4x+0.008 4，R2=0.996 1）。由图3b 可知，随着Fe3+浓度的增大，584 nm 处的荧光强度逐渐增强，Fe3+浓度在1×10-6～8.2×10-6mol/L 时，与荧光强度呈较好的线性关系（y=54.607x-44.136，R2=0.994 5）。

图3 RBr 与Cu2+（a）或Fe3+（b）的荧光光谱滴定关系Fig.3 Spectral titration of RBr with increasing concentrations of Cu2+(a) and Fe3+(b).

2.4 RBr 对Cu2+或Fe3+的识别机理

按照Job’s Plot 法［10］，确定了探针与Cu2+和Fe3+之间的配位关系，结果见图4。将RBr 和金属离子的总浓度保持在1×10-4mol/L，逐渐增大金属离子的浓度，测定最大吸收和发射峰值。由图4可知，当溶液中Cu2+的浓度与总物质的浓度之比为0.5 时，RBr 与Cu2+的络合物出现了最大吸光度值，这表明RBr 与Cu2+以1∶1 浓度比络合。同样，Fe3+的浓度与总物质的浓度之比为0.5 时，荧光发射强度出现最大值，络合浓度比也为1∶1。

图4 RBr 与Cu2+（a）或Fe3+（b）的配位关系Fig.4 Complexation between RBr-Cu2+(a) and RBr-Fe3+(b).

2.5 RBr-Cu2+紫外光照射测试

在RBr 溶液中加入过量的Cu2+后，分别在波长为254，365 nm 的紫外光源照射下进行测试。不同紫外光照射下的560 nm 处的吸收强度变化见图5。由图5 可知，随着254 nm 紫外光照射时间的逐渐延长，RBr-Cu2+的吸收强度逐渐增强；RBr-Cu2+络合物溶液在365 nm 紫外光照射下，吸收强度增大为初始值的2 倍。该络合物对测定365 nm的紫外光强度灵敏度高于254 nm，该络合物可用于户外紫外线强度的测定。

2.6 RBr 的pH 测试

为了表征RBr 在不同pH 条件下对金属离子的响应变化，分别选取559 nm 处的吸光度和584 nm处的荧光强度进行测试。不同pH 条件下的RBr 加入Cu2+或Fe3+前后光谱强度变化见图6。

图5 不同波长的紫外光照射下RBr-Cu2+溶液在560 nm 处的吸收强度变化Fig.5 Changes of absorbance intensity at 560 nm as a function of ultraviolet irradiation time.

由图6 可知，当溶液pH 为4～10 时，RBr 溶液的吸光度值变化不明显；加入Cu2+后，RBr 在pH 为7 时吸光度值达到最大。同样，溶液的pH 为6～10 时，RBr 的荧光强度变化不大；加入Fe3+后，RBr 溶液的荧光强度逐渐升高，在pH 为7 时荧光强度达到最大值。因此，RBr 的最佳测定条件为pH=7。

图6 不同pH 条件下RBr 加入Cu2+（a）或Fe3+（b）前后的光谱强度变化Fig.6 Spectral intensity changes of RBr added with Cu2+(a) and Fe3+(b) under different pH conditions.

3 结论

1）将罗丹明酰肼与对溴苯甲醛缩合制得RBr。

2）RBr 在乙腈/水（体积比为1∶1）溶液实现了对Cu2+的吸收识别及对Fe3+的荧光检测，并表现出良好的抗干扰性。RBr 溶液的吸收和荧光强度与Cu2+和Fe3+的浓度呈较好的线性关系。

3）RBr-Cu2+溶液吸光度随紫外光照射时间的延长而逐渐增强，该络合物可用于户外紫外线强度的测定。