XRCC3基因多态性与西北地区妇女乳腺癌的关联性研究

王 兰，张永东，郭红云，王 涛，王海涛，郭 欢，杨碎胜，李晓琴，苏海翔，*

(1．甘肃省医学科学研究院转化医学研究中心，甘肃 兰州 730050；2．甘肃省肿瘤医院乳腺肿瘤外科，甘肃 兰州 730050；3．甘肃省肿瘤医院病理诊断中心，甘肃 兰州 730050)

乳腺癌是女性发病率最高的癌症，也是女性癌症的主要死亡原因[1]。研究表明环境因素和生活方式可能导致乳腺癌或增加罹患乳腺癌的风险[2]，但也有研究发现，某些基因的多态性与乳腺癌的发病相关[3]。文献报告，XRCC3基因多态性在欧洲、中亚等妇女中与乳腺癌发病有相关性[4-5]。因此，我们选择XRCC3基因研究其与中国西北地区妇女乳腺癌发病的相关性，近年来的研究显示，非编码区的内含子在基因复制、转录、翻译过程中也扮演着重要的角色[6]，但这些区域内的基因多态性位点与乳腺癌的相关性报道较少。

本研究选取XRCC3基因位于启动子区域的4个多态性位点rs861534、rs861537、rs3212092、rs861530进行研究，拟通过检测XRCC3多态性位点的基因型与乳腺癌风险之间的关系，探讨XRCC3基因位点与中国西北地区妇女乳腺癌发生的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究人群

选取517例诊断为乳腺浸润性导管癌和其他分型的乳腺癌的患者，均为西北地区的汉族妇女，于2010年12月—2012年6月期间在甘肃省肿瘤医院就诊，所有的病例具有完整的临床资料和病理诊断资料，无其他癌症及乳腺癌家族史；另选取1 008例来自相同地区、年龄匹配的癌症筛查项目中健康体检人员作为空白对照组，空白对照组人员均被临床证实无乳腺癌和乳腺良性肿瘤疾病及肿瘤家族史；所有参与者已阅读并签署了知情同意书；研究内容通过了甘肃省肿瘤医院伦理委员会审查。

1.2 仪器及试剂

采用QuantStudioTM12k Flex Real-Time PCR System购于美国ABI公司，恒温水浴箱购于长风医疗器械厂，HZQ-C空气浴振荡器及NANODROP 2000均购于美国Thermo公司，小量全血基因DNA提取试剂盒购于北京百泰生物技术有限公司。荧光标记引物，DNA芯片和相应软件系统，质控探针和PCR实验试剂均由ABI生物技术中国有限公司提供。EnVision两步法免疫组化试剂盒，购自福州迈新公司。

1.3 DNA提取

对全部病例及正常体检人群各采集5 mL全血。按照全血DNA试剂盒提取步骤，抽提得到DNA，测定DNA浓度及D(260)/D(280)值，选用DNA浓度为50～100 ng/μL，D(260)/D(280)值为1.7～2.10的样本，-80 ℃保存、备用。

1.4 基因分型研究

采用高通量基因芯片技术，将PCR引物和探针预先嵌入在基因芯片中，每个芯片含有1 074位点，使用TaqMan OpenArray QuantStudio TM 12 k Flex测定基因芯片。①上样芯片制备：将2.0μL样本DNA和2.0μL反应液充分混合后，加入到384孔板中，再由配套的上样仪，将混合液添加到基因芯片的中，封盖，并加入专用油滴封闭加样口。②基因芯片模块创建：按照TaqMan软件操作程序，创建运行文库和芯片文件库。③运行芯片模块：将制备好的基因芯片放入TaqMan OpenArray QuantStudio TM 12 k Flex中，打开芯片文库中对应的文件，运行程序，对芯片上每个微孔中的反应液进行RT-PCR反应，然后测定反应结果。④结果分析：芯片运行结束，根据TaqMan芯片分析软件，将该张芯片基因分型结果输出为散点图及相应数据，再由ABI软件系统进行统计分析。实验结束，按照1%比率随机选择样本DNA测序技术分析，验证基因芯片结果。

1.5 乳腺癌相关临床病理学指标检测

E R、P R、P53、KI67受体采用免疫组织Envision法进行化学法检测；免疫组化染色评定依据2010年美国临床肿瘤学会(ASCO)/美国病理学家协会(CAP)评分系统。＞50%的细胞染色为强阳性(+++)，＞25%～50%的细胞染色为中等阳性(++)，＞1%～25%的细胞染色为弱阳性(+)，≤1%细胞染色为阴性(-)。Her-2受体采用免疫荧光原位杂交(FISH)与免疫组化相结合的方法进行检测；参照中国抗癌协会乳腺癌诊治指南中标准：细胞重度的全细胞膜染色＞10%为阳性(+++)，＞10%的细胞轻至中度的全细胞膜染色为阳性(++)，＞10%的细胞轻度的全细胞膜染色或＜10%细胞膜染色为阴性(-)；若免疫荧光原位杂交检测为阴性，则确定Her-2为阴性，若FISH检测显示阳性，则定义Her-2为阳性。

1.6 统计分析

应用SPSS 16.0统计软件处理数据，以α=0.05为检验水准；使用多因素Logistic回归法分析SNP等位基因和基因型，病例组和对照组分别进行评估。多因素Logistic回归计算比值比(odds ratios，OR)及其95%可信区间(confidence intervals，CI)，分析各基因型与乳腺癌发生的易感性及相关性；计数资料采用卡方检验。

2 结果

2.1 XRCC3单个基因多态性与乳腺癌风险分析

对所有样本进行基因型分型(见图1、2)，经卡方检验，XRCC3各基因型频率的偏差符合Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)定律(见表 1)。对 XRCC3 的4个多态性位点的基因型和等位基因进行比较研究，结果显示XRCC3 rs861534位点的AG/AA基因型，乳腺癌组与对照组比较分布差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)。Logistic回归分析发现，乳腺癌组中AG/AA基因型与对照组比较差异有统计学意义[OR=0.36，95%CI(0.27， 0.50)； OR=0.08， 95%CI(0.01， 0.58)]，同时，GG+AG基因型与对照组比较差异有统计学意义[P＜0.01，OR=2.91，95%CI(2.17，3.89)]，AG+AA基因型与对照组比较有统计学意义[P=0.02，OR=10.66、95%CI(1.42，79.99)]；rs861534位点单基因比较可知，乳腺癌A基因携带者与对照组比较差异有统计学意义[P＜0.01，OR=0.37，95%CI(0.28，0.49)]。研究发现XRCC3 rs861530位点的Logistic回归分析显示AG+AA基因型与对照组比较有统计学意义[P=0.044，OR=0.78，95%CI(0.62，0.99)](见表2)。研究中没有发现XRCC3 rs861537和XRCC3 rs3212092两个位点各基因型与对照组有明显差异。

图1 基因芯片结果分析图

图2 芯片位点图

表1 XRCC3各位点基因型Hardy-Weinberg平衡检测

表2 XRCC3基因多态性与乳腺癌发病风险性研究

2.2 XRCC3基因多态性与癌组织中乳腺癌相关临床病理学指标表达的分析

乳腺癌相关临床病理学指标雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体(Her-2)、P53、KI67，在乳腺癌治疗和复发用药选择时具有重要的参考价值。本研究通过对乳腺癌患者各基因型与相关临床病理学指标分析显示，在乳腺癌患者中rs861537多态性位点AA、AG、GG三种基因型携带者在ER阳性与阴性蛋白中分布差异无统计学意义(P＞0.05)；但Logistic回归分析发现rs861537位点的GG+AG基因型ER蛋白阳性与阴性分布差异有统计学意义[P=0.048，OR=1.50，95%CI(1.00，2.23)]；对于其他rs861534、rs861530、rs3212092三个位点的ER+与ER-蛋白表达与各基因型比较，差异无统计学意义(见表3)。在rs3212092多态性位点，Logistic回归分析显示CT基因型癌组织中，Her-2-与Her-2+蛋白表达差异有统计学意义(P=0.049)，CC+CT基因型癌组织中亦有统计学意义[P=0.027，OR=2.06，95%CI(1.08，3.90)]。对于其他3个位点：rs861534、rs861530、rs861537各基因型癌组织的Her-2+与Her-2-蛋白表达差异无统计学意义(见表4)。研究显示XRCC3 rs861534、rs861537、rs3212092及rs861530四个位点各基因型与PR、P53、KI67等乳腺癌相关临床病理学指标无统计学意义。

表3 XRCC3基因多态性与ER相关性研究

3 讨论

大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病相关联，包括肿瘤相关的基因突变[7]；对基因SNP位点的研究可用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等[8]。

暴露于同样的危险因素的个体患乳腺癌的风险却不相同，说明个体遗传背景不同导致了易感性的差异性[9]；流行病学研究也表明，基因多态性与乳腺癌的患病风险相关[10]。研究报道显示XRCC3基因多态性与乳腺癌的发病密切相关[11]；在2002和2004年，英美的学者研究报道XRCC3 rs861539位点纯合子AA基因型与欧美地区妇女的乳腺癌发病具有高度风险性[12-13]；随后的研究证实与大多数亚洲妇女乳腺癌发病也具有相关性[14]。最近的数据表明XRCC3 rs1799794可略微增加女性的纯合子等位基因的乳腺癌患病风险[11]。研究证实XRCC3 rs1799794、rs1799796多态性位点与沙特妇女乳腺癌发病风险明显相关，但与其他地区妇女乳腺癌发病无相关性[15]。

表4 XRCC3基因多态性与Her-2相关性研究

DNA修复机制可防止癌基因激活，纠正在DNA复制过程中的基因缺失、插入等，通过DNA损伤修复机制可维护基因的稳定性，在预防DNA复制过程中引起的基因癌变发挥了重要作用[16]。研究表明，大多数家族集聚类乳腺癌是遗传因素的结果；同卵双胞胎与异卵双胞胎比较，同卵双胞胎姐妹乳腺癌发病率明显较高；这一现象可以解释为一些特定的基因突变，引起带来疾病的罹患风险增加[17]。由此可知，乳腺癌的发病最主要是由于基因型的不同，而不是生活方式或环境因素引起。

雌激素受体(ER)是乳腺中正常的激素受体，当乳腺上皮细胞发生癌变时，ER将会部分或全部缺失，如检测到肿瘤组织中有ER表达，则表明肿瘤细胞可以接受内分泌调节，因此可以采取内分泌治疗，对临床治疗及预后评价具有指导价值[18]。研究显示，在浸润性乳腺癌组织和转移的腋下淋巴结中均可见Her-2蛋白的高表达，表明Her-2的高表达与乳腺癌患者的无病存活期及肿瘤复发高度相关联[19]；Her-2被认为是判断乳腺癌患者预后和分子靶向治疗的关键性标志物[20]。

研究表明，XRCC3是中国北方妇女乳腺癌的易感性基因[21]，本研究也显示两个SNP位点对乳腺癌具有潜在的致病风险；在本研究收集的乳腺癌患者样本中我们观察到，在XRCC3基因4个位点rs861534、rs861537、rs3212092、rs861530中，rs861534位点携带GG/AG基因型和rs861530位点具有AG/AA基因型者，其罹患乳腺癌的风险较高；对于这两个多态性位点与乳腺癌风险性关系，以前文献中还没有相关报道。其他XRCC3基因位点rs861537、rs3212092与乳腺癌的发病风险无相关性。我们还比较了乳腺癌患者的相关临床病理学指标与各位点基因型的关联性，结果表明，乳腺癌组织中雌激素受体(ER)表达阳性和阴性的患者相比较，在XRCC3 rs861537位点GG/AG基因型的ER-与ER+患者具有微小的差别，提示ER+的乳腺癌患者携带者GG/AG基因型可能具有较高的内分泌治疗风险，预后较差；在rs3212092位点，与Her-2-蛋白表达患者相比较，Her-2+表达患者并携带CT和TT基因型，预后不良，并具有明显复发转移风险，在以后的分子靶向治疗中也不会获益；另外，Her-2蛋白高表达的肿瘤多同步伴随p53基因的突变，在肿瘤耐药性方面具有协同作用，对患者的病情、预后及化疗效果有负面影响[22]。

在此后研究中，我们还将进行其他碱基修复基因，如APEX1、MUTYH、OGG1等基因的分析研究，扩大样本量，并且进一步收集入选的患者及健康人其他信息，如生活环境、生活习惯等其他信息，进行分层分析，并对不同位点和基因间进行交互关系和关联研究，以及功能学的研究，寻找西北地区与乳腺癌易感性相关的易感基因型，并将其作为西北妇女特有的分子标志物用于筛选高危和易感人群，为实现精准医疗、个体预防和治疗提供科学依据。