HHV-6A感染对神经胶质瘤细胞Ln cRNA M EG 3表达及增殖凋亡侵袭转化的影响

万 昕，胡 月，章 菊，陈 云，金佩佩，*

(1．中国科学技术大学附属第一医院/安徽省立医院检验科，安徽 合肥 230036；2．中国科学技术大学附属第一医院/安徽省立医院妇产科产前诊断中心，安徽 合肥 230036；3．南京医科大学微生物与免疫学系，江苏 南京 211100)

神经胶质瘤是大脑中最常见的原发性肿瘤，约占所有脑恶性肿瘤的50%～60%[1]。传统治疗恶性脑胶质瘤的首选方法是手术切除，再辅以化疗、放疗或综合放化疗，但是胶质瘤的发病机制复杂，加之其侵袭性生长等特性都使得临床治疗策略受到很大限制[2-4]。因此，进一步了解胶质瘤相关发病机制显得尤为重要。

最新研究提示病毒也可能是神经胶质瘤的重要诱发因素。人类疱疹病毒6型(human herpesvirus 6，HHV-6)是一类嗜人淋巴细胞双链DNA病毒，可分为A和B两个亚型[5]。其中HHV-6A亚型被认为与多种神经系统疾病包括神经胶质瘤存在相关性[6]。在胶质瘤组织中可检测到高百分比的HHV-6A核酸及蛋白质成分，同时HHV-6A感染也可上调星形胶质细胞分泌促炎细胞因子[7]。众多研究显示HHV-6A可能是一种影响胶质瘤发生发展的重要潜在病原体，但是其具体的致病或调控机制还有待进一步探索和验证。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是近年研究发现的一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，它通过多种途径调控肿瘤基因或者控制细胞增殖和循环[8-9]。目前已有若干LncRNAs被认为在恶性脑胶质瘤发生发展过程中起到重要的调节作用[10-11]，但具体作用机制仍不清楚。高通量RNA测序结果显示LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET在胶质瘤及其癌旁组织中的表达有显著差异，且表达峰及稳定性均较好，同时已有研究认为在胶质瘤及其他若干肿瘤中LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET与癌症的发生发展都具有密切的相关性[12-15]。为了进一步观察LncRNAs对胶质瘤的调控作用以及明确其表达是否和HHV-6A感染存在相关性，本研究选取与胶质瘤发病相关性较强的LncRNA MEG3，同时验证其表达与HHV-6A感染的相关性，并对病毒感染后神经胶质瘤细胞增殖、凋亡及上皮间充质转化(epithelialmesenchymal transition，EMT)等情况进行观察，以揭示HHV-6A对胶质瘤发生发展的可能调控方式。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

人星形胶质细胞株HA-1800购自美国ATCC公司，U251、U87及U373等人神经胶质瘤细胞购自中科院上海细胞库，HHV-6A GS标准株及人急性淋巴母细胞白血病细胞(HSB-2)由南京医科大学微生物与免疫实验室保存提供。DMEM/F12培养基和DMEM培养基购自美国Hyclone公司，RPMI1640培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司，实时定量PCR试剂盒购自瑞士Roche公司，CCK-8试剂盒及RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司，Annexin V/PI凋亡试剂盒购自美国Invitrogen公司，Snail、E-cadherin、Vimentin及GAPDH等单克隆抗体均购自美国Cell Signaling公司，抗兔IgG二抗购自美国Santa Cruz公司，ECL显影液购自美国Thermo公司。实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，流式细胞仪购自美国BD公司，倒置光学显微镜购自德国Zeiss公司。

1.2 临床标本收集

实验涉及的37例胶质瘤组织、4例癌旁组织以及18例正常脑组织等人体标本均收集于南京医科大学第一附属医院神经外科手术后(2017年1月—2018年1月)，患者年龄25～70岁。进一步统计胶质瘤患者各临床指标(性别、年龄、肿瘤大小及分级等)，并分析这些指标与胶质瘤组织中LncRNA MEG3的表达高低是否有关系。所有样品的采集均获得肿瘤患者和志愿者的同意，且研究涉及的实验获南京医科大学研究伦理委员会和江苏省机构审查委员会的批准。

1.3 实时定量PCR

在GenBank中搜索目的基因序列，使用Primer Premier 5.0软件辅助设计并结合文献报道，最终筛选确定PCR引物序列：LncRNA MEG3，上游GAGTG TTTCCCTCCCCAAGG；下游GCGTGCCTTTGGTGATT CAG。LncRNA H19，上游TCAAGCCTGGGCCTTTG AAT； 下 游 CTGCTGTTCCGATGGTGTCT。 LncRNA LET，上游GTGACTCCCTCCAGATGTGC；下游ACTC TTGCCTTGGGAGTCCT。β-actin，上游 TGGCACCCA GCACAATGAA；下游CTAAGTCATAGTCCGCCTAGA AGCA。收集临床胶质瘤组织及对应癌旁组织或正常脑组织标本，提取组织总RNA并反转录为cDNA，后续使用荧光实时定量PCR(qPCR)试剂盒配置20μL体系进行扩增，根据扩增曲线，由ABI 7500软件系统严格分析获CT得均值，以β-actin为内参校正浓度差异引起的误差，最终以 2-ΔΔCT法计算分析出各个样本目的LncRNAs的相对表达水平。

1.4 细胞培养和病毒感染

取对数生长期的HSB-2细胞，以一定浓度(1×105/mL)种于6孔细胞培养板中，加入含10%FBS的RPMI 1640培养基进行培养。24 h后，在每孔中接种100 μL HHV-6A GS病毒液，当HSB-2细胞病变效应大于80%时收集细胞悬液并测定病毒滴度(病毒滴度为各孔中CPE细胞平均数除以每孔中含有的病毒液体积)。根据所测定病毒滴度，用含2%FBS的RPMI 1640培养基配置病毒悬液，用于感染人神经胶质瘤或人星形胶质细胞(MOI=10)。后续选取HHV-6A病毒感染不同时间点(0、6、12、24及48 h)的正常神经胶质细胞株HA-1800以及感染24 h的神经胶质瘤细胞株U373，U251和SHG44细胞为实验组，并以未经感染的细胞作为对照组。分别提取感染组及对照组细胞RNA并反转录为cDNA，同样通过荧光实时定量PCR检测分析感染前后各组细胞中LncRNA MEG3的表达变化。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖情况

选取LncRNA MEG3表达水平较高的胶质瘤细胞U373进行HHV-6A的感染培养，并以未感染的正常U373细胞作为对照。收集病毒感染前后细胞，调整细胞密度接种到96孔细胞培养板中(每孔1×103个)，加入胎牛血清，置于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。分别于培养不同时间(24、48、72和96 h)取出培养板并在每孔细胞中加入10μL CCK-8溶液，再继续孵育4 h后以测定吸光度D(450)值。以病毒感染组和对照组细胞的吸光度值为纵坐标，以培养时间为横坐标绘制生长曲线，观察细胞增殖情况。

1.6 细胞凋亡率检测

收集HHV-6A感染24 h后及未感染的胶质瘤细胞U373，PBS漂洗3次后按试剂盒说明分别加入Annexin V和碘化丙啶(propidium iodide，PI)，避光孵育染色后采用流式细胞术检测细胞凋亡率。

1.7 划痕实验

将U373细胞接种在6孔板中，添加完全培养基使其生长至汇合，通过HHV-6A感染U373细胞。24 h后弃除培养基，并使用移液枪头尖端刮擦细胞面产生划痕。小心移除刮脱的细胞并添加无血清培养基继续培养，24 h后通过倒置光学显微镜观察病毒感染和未感染的细胞，使用Image J软件计算分析感染组和对照组细胞划痕的愈合程度(划痕面积及伤口愈合比)，以观察病毒感染前后U373细胞迁移能力的变化。

1.8 Western blot法检测

分别取HHV-6A感染24 h后的U373细胞以及未感染病毒的对照组细胞，使用RIPA裂解液分别裂解病毒感染前后的细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取50μg蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，后将蛋白印迹转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h，再分别加入一抗(兔抗人Snail、兔抗人E-cadherin、兔抗人Vimentin或兔抗人GAPDH)，4℃孵育过夜。洗除一抗后，添加HRP标记的羊抗兔二抗(1∶2 000稀释)，继续孵育1 h。最后使用ECL法进行显影检测，并通过灰度扫描分析蛋白相对表达水平。

1.9 统计学方法

使用GraphPad Prism 6.0软件统计分析所得数据。胶质瘤组织与癌旁组织/正常脑组织的LncRNA表达水平，病毒感染与对照组细胞增殖凋亡及侵袭转化等计量数据均以平均值±标准差形式表示，差异分析采用t检验。临床计数资料通过例数表示，LncRNA MEG3表达高低分别与性别、年龄、肿瘤大小或肿瘤分级构成两组变量的四格表数据，均分别采用Fisher's卡方检验，而在已确认的HHV-6A阳性胶质瘤患者中，LncRNA MEG3高低表达例数的差异应用t检验分析，P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤组织中相关LncRNAs的表达水平检测

收集提取4例神经胶质瘤患者的肿瘤及对应癌旁组织RNA，通过qPCR分别测定其中LncRNA MEG3、LncRNA H19和LncRNA LET的表达水平。结果显示，相对癌旁组织，肿瘤组织中仅LncRNA MEG3的表达明显降低(图1A)，LncRNA H19和LncRNA LET的表达差异无统计学意义(图1B和图1C)。进一步收集33例胶质瘤患者肿瘤组织及18例正常脑组织，用qPCR检测验证其中LncRNA MEG3的表达水平。结果证实，LncRNA MEG3在胶质瘤组织中的表达水平显著低于正常脑组织(P＜0.05，图1D)。

临床资料结果显示LncRNA MEG3的表达高低与性别、年龄及肿瘤大小无关，而LncRNA MEG3低表达的胶质瘤患者构成比在分级越高的患者中大于分级低的患者(P＜0.05)。同时，在HHV-6A感染相关的胶质瘤中，LncRNA MEG3也更多地呈现出低表达趋势(P＜0.05，表1)。

2.2 HHV-6A感染下调神经胶质细胞及胶质瘤细胞LncRNA MEG3的表达水平

图1 实时荧光定量PCR检测胶质瘤组织中相关LncRNAs的表达

表1 LncRNAMEG3表达与胶质瘤患者临床指标(n=33)

实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，在HHV-6A感染HA-1800细胞6h后，该神经胶质细胞中LncRNAMEG3的表达即开始明显减少(P＜0.01)，并随着感染时间的延长而表达持续降低(图2A)。此外，实时定量PCR结果同样显示，与未感染病毒的对照组细胞相比，在HHV-6A感染后24h，U373、U251和SHG44这3种胶质瘤细胞株中LncRNAMEG3的表达水平较感染前显著降低(P＜0.01)；而在未经HHV-6A病毒感染的情况下，3种胶质瘤细胞株中LncRNAMEG3的表达水平也明显低于正常的胶质细胞株(图2B)。

2.3 HHV-6A感染对神经胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

图2 实时荧光定量PCR检测HHV-6A感染前后神经胶质及胶质瘤细胞LncRNAMEG3的表达

CCK-8法检测感染前后不同时间点(24、48、72和96h)胶质瘤细胞U373的增殖情况，细胞生长曲线显示，与未感染病毒的对照组细胞相比，在病毒感染48h时U373细胞的生长曲线有所升高，且差异具有统计学意义(P＜0.05，图3A)。Annexin V/PI双染色及流式分析结果显示：HHV-6感染后U373细胞的凋亡率[(6.05±0.40)%]显著低于未感染组细胞[(8.23±0.75)%]，差异具有统计学意义(P＜0.05，图3B和3C)。

图3 HHV-6A感染后U373细胞增殖及凋亡检测

2.4 HHV-6A感染促进神经胶质瘤细胞的侵袭与EMT

通过细胞划痕实验观察病毒感染(24 h)后胶质瘤细胞U373的迁移能力，结果见图4。显示未感染病毒的对照组细胞划痕愈合度为(43.67±6.30)%，病毒感染后U373细胞划痕愈合度为(72.33±6.90)%，提示病毒感染后U373细胞侵袭能力较未感染细胞增强(P＜0.05)。

图4 划痕实验观察HHV-6A感染后U373细胞的侵袭情况

在HHV-6A感染U373细胞24 h后，通过Western blot检测感染前后U373细胞中Snail、E-cadherin及Vimentin蛋白的表达水平并做统计分析。结果显示，病毒感染后U373细胞中Snail及Vimentin蛋白的表达升高，而E-cadherin蛋白的表达降低(P＜0.05，图5)，提示HHV-6A感染可能促进神经胶质瘤细胞的上皮-间质转化。

3 讨论

众多研究认为HHV-6与多种神经系统疾病的发生发展相关，如多发性硬化、癫痫以及神经胶质瘤等[16]。与正常脑组织相比，在神经胶质瘤组织中可检测到较高阳性率的HHV-6 DNA、早期蛋白以及晚期蛋白，同时在神经胶质瘤囊液中也能分离到HHV-6A病毒，这些研究结果均提示HHV-6和人神经胶质瘤有关[6，17]，但其具体作用机制仍然不是很清楚。

图5 Western b lot检测HHV-6A感染后U373细胞上皮间质转化指标蛋白

LncRNA MEG3已被证实在多种肿瘤包括神经胶质瘤发展过程中起着重要的调控作用[12，18]。本研究发现：与癌旁或正常脑组织相比，LncRNA MEG3在胶质瘤组织中表达明显降低，且胶质瘤细胞株中LncRNA MEG3的表达也较正常神经胶质细胞株低，借此推断MEG3表达降低可能导致或促进胶质瘤的发生。值得注意的是，LncRNA MEG3低表达的胶质瘤组织显示出更高的HHV-6A阳性率。体外感染细胞实验显示HHV-6A感染同样可使胶质瘤细胞中LncRNA MEG3的表达持续下调，因此提示HHV-6A感染可能是引起LncRNA MEG3的表达下调，并进一步促进胶质瘤发生的重要原因之一。

LncRNA被认为可通过调控细胞增殖、凋亡、迁移和EMT等功能来影响癌症的发生。EMT在肿瘤侵袭和转移的过程中扮演着十分重要的角色，其主要的特征是上皮细胞连接蛋白如E-cadherin的丧失、间充质标记物如Vimentin的增加和细胞骨架重组等[19]。Snail蛋白家族是一类非常不稳定的转录因子，对翻译后修饰很敏感，可通过羧基末端的锌指结构域与E盒的DNA序列结合来抑制上皮细胞相关基因的表达，从而在EMT的发生和调控中扮演着重要的角色，MAPK的激活可直接上调Snail表达，并触发PI3K等信号诱导EMT发生[20]。本研究在明确HHV-6A感染可以下调胶质瘤细胞LncRNA MEG3的基础上，进一步发现HHV-6A感染可以促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力，并抑制其凋亡。同时，病毒的感染也加快了其EMT进程。ZHANG L等人[21]发现过表达LncRNA MEG3可以抑制神经胶质瘤细胞U251的增殖，并促进其凋亡。动物实验也表明LncRNA MEG3的高表达可以抑制胶质瘤的发生及进展。此外，QIN等人[14]也证实了MEG3可作为miR-19a的竞争性内源性RNA来抑制胶质瘤细胞的增殖，迁移和侵袭。虽然下调LncRNA MEG3的表达可能只是HHV-6A促进胶质瘤发生的诸多调控机制之一，且其下游的具体信号通路仍需要深入探索，但这些结果为进一步研究HHV-6A在人神经胶质瘤以及其他相关中枢神经系统疾病中的作用机制研究提供了新的思路。