PINK1沉默对肺癌细胞增殖和凋亡的影响

申秋菊，赵静，王二雄，白晓瑞

(榆林市第一医院呼吸内科，陕西 榆林 719000)

肺癌是高死亡率的癌症之一，约占所有癌症死亡人数的1/5[1]。目前，手术切除、放射治疗及化学治疗仍是其最常见的治疗方法，但疗效并不理想，患者5年生存率仅为15%[1-2]。因此，迫切需要寻求一种新的更为有效的肺癌治疗方法。PTEN诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1)在肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用，可通过介导功能障碍的线粒体募集，进而促进受损线粒体通过自噬作用消除[3]，并和Parkin蛋白一起，在细胞凋亡中发挥重要作用。对乳腺癌和宫颈癌细胞的研究[4]显示，PINK1敲低可显著抑制癌症相关表型，并阻断癌细胞的细胞周期进程。同时，PINK1下调可增加非小细胞肺癌对顺铂的敏感性[5]。此外，近期Yamashita等[6]的研究证明，高表达的PINK1可能会导致食管鳞状细胞癌患者的化疗耐药性和不良预后。虽然这些研究已经阐明了PINK1在多种癌细胞中的作用，但PINK1在肺癌中的详细机制还尚未完全清楚。本研究采用特异性PINK1-短发夹RNA(shRNA)沉默肺癌细胞中PINK1的表达，探讨PINK1沉默在肺癌细胞增殖、凋亡和线粒体功能障碍中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

人肺癌细胞系H2106购自美国ATCC细胞库，shRNA-对照质粒和shRNA-PINK1质粒由上海生工生物工程股份有限公司提供及合成，pENTRTM/H1/TO载体和脂质体2000购自美国Invitrogen公司，遗传霉素购自美国 Sigma-Aldrich公司，MTT试剂盒、细胞周期及细胞凋亡试剂盒购自上海碧云天公司，线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法)试剂盒、线粒体提取试剂盒、活性氧(ROS)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，BCA试剂盒、RIPA试剂、Bax抗体、Bcl-2抗体、GAPDH抗体、二抗购自上海碧云天公司，PINK1抗体和活性caspase3抗体购自美国Abcam公司，FACS Calibur流式细胞仪由美国BD公司生产，imark酶标仪由美国伯乐公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组及转染 (1)细胞培养：将人肺癌细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞铺满瓶底后，采用0.25%的胰酶消化，进行传代培养，取对数生长期的细胞用于后续实验；(2)细胞分组：将细胞分为空白组(未转染质粒)、阴性组(转染shRNA-对照质粒)和转染组(转染shRNA-PINK1质粒)。(3)细胞转染：将shRNA-PINK1基因或shRNA-对照基因分别克隆进pENTRTM/H1/TO载体中构建pENTRTM/H1/TO-shRNA-PINK1(简称shRNA-PINK1质粒)和pENTRTM/H1/TO-shRNA-对照(简称shRNA-对照质粒)重组质粒，然后采用脂质体2000将shRNA-PINK1质粒(转染组)或者shRNA-对照质粒(阴性组)转染至H2106细胞中。转染48 h后，将150 g/mL的遗传霉素加入转染组和阴性组的细胞培养基中。2周后，筛选稳定表达PINK1干扰载体的H2106细胞；空白组不做处理。人shRNA-PINK1基因的序列为：5′-CACC GCTGGAGGAGTATCTGATA TTCAAGAGA TATCAGATACTCCTCCAGC-3′，shRNA-对照基因的序列为：5′-CACC GCTAGGATATGGTCGGATA TTCAAGAGA TATCCGACCATATCCTAGC-3′。

1.2.2 细胞增殖抑制率检测 将各组细胞以5103/孔的密度接种于96孔板，每组8孔。设空白孔，只加RPMI-1640培养基。分别于转染后0、6、12、24、48和72 h，加入5 mg/mL的MTT溶液20 L，反应4 h，用快速翻板法去除培养基，加200 L的DMSO，振荡10 min，30 min后用酶标仪在490 nm处检测吸光值(OD)。细胞增殖抑制率(%)=[(空白孔OD值-待测孔OD值)/空白孔OD值]100%。

1.2.3 细胞周期及细胞凋亡检测 收集转染48 h后的细胞，加入1 mL 细胞固定液，吹打混匀，在4 ℃固定24 h。用PBS洗去固定液，1 000 rpm离心5 min，用0.5 mL的PBS重悬细胞。加入0.5 mL PI，室温避光孵育30 min，用流式细胞仪在激发波长488 nm处检测每组处于各细胞周期的细胞所占的百分比。收集转染48 h后的细胞，加入5 L AnnexinV-FITC，混匀，室温避光孵育10 min，离心收集沉淀，重悬后加入10 L PI，室温避光孵育15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 Western Blot检测PINK1、活性caspase3、Bax和Bcl-2等蛋白表达水平 用RIPA试剂从转染48 h后的各组细胞中分离总蛋白，采用BCA试剂盒进行总蛋白定量。采用10% SDS-PAGE分离总蛋白，转膜后用5%的BSA封闭45 min，分别加入PINK1、活性caspase3、Bax和Bcl-2一抗，37℃孵育4 h；加入各自二抗(1∶5000)，室温摇床孵育1 h后，ECL暗室发光。采用凝胶成像系统和Quantity One 4.6.2软件(美国Bio-Rad公司)对条带进行统计分析。内参为GAPDH。蛋白相对表达量=检测蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率的对比

在转染12、24、48和72 h时，转染组细胞增殖抑制率均高于空白组和阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)，空白组与阴性组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2 各组细胞周期和凋亡率对比

与空白组和阴性组对比，转染组S期细胞数量降低、G2/M期细胞数量增加、细胞凋亡率降低，差异有统计学意义(P<0.05)，空白组与阴性组比较，各期细胞和细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 各组细胞周期和凋亡率对比

*P<0.05，与空白组和阴性组相比。

2.3 各组PINK1等蛋白表达水平对比

与空白组和阴性组对比，转染组活性caspase3和Bax表达水平增加、PINK1和Bcl-2表达降低(P<0.05)，空白组与阴性组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2和表2。

表2 各组PINK1等蛋白表达水平对比

分组PINK1active caspase3BaxBcl-2空白组(n=8)0.87±0.1040.42±0.1150.26±0.0830.51±0.096阴性组(n=8)0.92±0.0840.38±0.0890.29±0.0900.56±0.124转染组(n=8)0.33±0.050*1.16±0.132*1.47±0.146*0.20±0.079*

*P<0.05，与空白组和阴性组相比。

3 讨论

PINK1在肺癌细胞中高表达，可促进癌细胞恶性增殖以及化疗耐药性[6]。本研究采用RNA干扰技术，将shRNA-PINK1质粒转染入人肺癌细胞H2106中沉默PINK1，借以探讨PINK1沉默对肺癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等的影响。

本研究结果显示，PINK1沉默可显著增加肺癌细胞的增殖抑制率。其原因可能是PINK1可通过调节细胞增殖、细胞周期和线粒体功能，进而促进肿瘤的发展[3]，也可以说，PINK1为促肿瘤因子，而其沉默将可能导致肿瘤生长抑制。结果还显示，PINK1沉默后，G2/M期的细胞构成比显著增加，而S期细胞构成比降低。G2为有丝分裂的准备期，M期为有丝分裂期，G2/M期细胞构成比增加表示细胞有丝分裂进入延迟，细胞可能在修复S期累积的DNA损伤。有研究[7]证实，在wee1蛋白缺乏的情况下，将导致细胞没有完成DNA修复就直接进入有丝分裂期，但在进入有丝分裂期后，G2/M期的DNA检查点将会发出不利于分裂的信号(由于DNA修复未完成)。因此，导致细胞在G2/M期滞留，有丝分裂未启动。这可能是PINK1沉默导致肺癌细胞增殖抑制的原因之一。

细胞凋亡逃逸是癌细胞的一个显著特征，且越来越多的研究[8]表明，PINK1在多种细胞模型中具有抗凋亡作用。因此，本研究试图探讨PINK1沉默在肺癌细胞凋亡中的作用，结果显示，PINK1沉默能显著增加肺癌细胞的凋亡率，其机制可能与PINK1沉默降低肺癌细胞中Bcl-2蛋白表达、提高Bax蛋白表达及caspase-3活化有关。Bax和Bcl-2蛋白均是内在线粒体依赖性细胞凋亡的关键参与者，Bax为促凋亡蛋白，会加速细胞凋亡过程，反之Bcl-2为抗凋亡蛋白，会阻止细胞凋亡过程[9]。Caspase-3是caspase家族之一，是促凋亡蛋白，可由线粒体依赖的内在凋亡途径和死亡受体触发的外源性凋亡途径激活[10]。据此推测，由caspase-3及Bax/Bcl-2启动的线粒体依赖凋亡途径可能也是PINK1沉默促进肺癌细胞凋亡的原因之一。

综上，PINK1沉默可抑制肺癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，PINK1可能是肺癌治疗的另一个新靶点。