肉苁蓉提取物对快速老化模型小鼠SAMP8行为学及肠道菌群的影响＊

付志飞，杨 丽，尚 非，戴永娜，赵 鑫＊＊

（1.天津中医药大学中医药研究院 天津 301617；2.天津中医药大学临床实训教学部 天津 301617）

阿尔兹海默病（Alzheimer's disease,AD）是一种严重的中枢神经系统退行性疾病，其病因及发病机制尚未阐明，至今尚无有效的防治药物，且随着人口老龄化发展，发病率逐年升高[1]。目前临床上用于治疗AD的药物主要为胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，但存在疗效不确切、作用靶点单一、毒副作用大的缺点。因此，研发高效、低毒、多靶点的阿尔兹海默病防治药物是临床治疗的迫切需求。肉苁蓉具有抗阿尔兹海默病作用，目前对其抗阿尔兹海默病研究大多集中于苯乙醇苷类化合物，肉苁蓉总苷可以提高SAMP8小鼠空间学习记忆能力，降低脑组织丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）活性以及海马体细胞的存活率[2]，但此类化合物口服后代谢途径广泛，生物利用度极低，难以解释其体内药效物质基础[3]。而肉苁蓉另一主要成分为多糖，前期文献调研发现其具有增强免疫、抗氧化及抗肿瘤等作用[4]，在胃肠道内二者将不可避免地相互作用。本部分旨在研究肉苁蓉不同组分单独使用与联合使用对SAMP8 小鼠的学习记忆及肠道菌群的影响，以期为开发肉苁蓉开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

8.5 月龄雄性SAMP8 快速老化小鼠和8.5 月龄雄性SAMR1 正常老化小鼠，SPF 级，均由天津中医药大学第一附属医院提供，动物饲养于天津市放射医学研究所，室温23±2℃。相对湿度58-65%。

1.1.2 试剂与药材

肉苁蓉，购自内蒙古阿拉善盟，内蒙古曼德拉沙产业开发有限公司，经鉴定为荒漠肉苁蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma。肉苁蓉药材3.0 kg，切片，45℃烘干，粉碎后，加入85%乙醇，60℃下提取两次，每次2 h，料液比分别为1∶12，1∶10。提取液经浓缩后，D101大孔树脂纯化，制备液相分离，制得松果菊苷，纯度经HPLC 法测定为96.2%。药渣挥干乙醇后，100℃沸水提取，料液比分别为1∶12，1∶10，提取2次，每次2 h，提取液趁热离心，浓缩后，加入95%乙醇调节乙醇的终浓度为80%，4℃醇沉过夜，沉淀用无水乙醇洗涤数次，得肉苁蓉粗多糖，提取率约为11.0%。

1.1.3 实验仪器与试剂

Morris 水迷宫设备（淮北正华生物仪器设备有限公司）：包括不锈钢恒温水池、电脑摄像系统、配套软件分析系统；美国Agilent 1200 高效液相色谱系统：配置在线真空脱气机（G1379B）、高压四元梯度泵（G1312A）、自动进样器（G1328A）、柱温箱（G1316A）、二极管阵列检测器（G1314A）（美国Agilent 公司）；色谱柱：Waters XTerra RP18，4.6×250 mm，5μm（美国waters 公司）；松果菊苷标准品（上海源叶生物有限公司）；粪便DNA提取试剂盒（Qiagen，德国）；超纯水设备（美国Millipore公司）；乙腈为色谱纯（美国Fisher）；其余试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与给药

实验动物共分为5组：SAMR1正常对照组（n=10）、SAMP8 模型组（n=9）、肉苁蓉多糖组（ZT，n=14）、松果菊苷组（ECH，n=11）以及肉苁蓉多糖和松果菊苷联合给药组（n=13），每天灌胃给药1次，连续31 d，ZT组给药剂量200 mg·kg-1，ECH 组给药剂量60 mg·kg-1，ZT+ECH组给药剂量200 mg·kg-1ZT+60 mg·kg-1ECH，SAMR1 组给予同体积的生理盐水。第26 d 于无菌条件下采集粪便，第27-31 d进行水迷宫实验，期间不间断给药，第32 d处死，解剖，取胸腺、脾脏，计算胸腺、脾脏指数并进行统计。

1.2.2 Morris水迷宫实验

根据文献方法[5]，进行Morris 水迷宫实验，包括定位航行实验和空间探索实验。水迷宫置于房间中间，为一圆形水池，水温保持在±22℃。将水池等分为东（E）、南（S）、西（W）、北（N）四个象限，在一象限中心放置一圆形平台，平台低于水面2 cm。水迷宫正上方高处装有一个小型摄像机，并与录像机和监视器连接，记录小鼠的游泳轨迹和游泳时间。观察小鼠的精神状态、活动情况。在第27 d，每天上、下午定位航行训练各一次，连续4 d。每天将小鼠面向池壁分别从2个不同的标记点轻轻放入水中，记录60 s 内其找到水下平台所花费的时间（逃避潜伏期，escape latency），找到平台后允许小鼠在平台上停留10 s，如果小鼠在60 s内未找到平台，则引导小鼠登上平台，并在平台上停留10 s，让其根据周围参照物进行空间学习记忆。第5 d移除隐藏的平台，按同一地点将小鼠放入水池，记录60 s内小鼠经过平台的总次数及原平台象限的活动时间。

1.2.3 粪便微生物DNA 提取及Illumina HiSeq 高通量测序

DNA 提取：在试验第26 d 取SAMR1 组、SAMP8组、ZT组、ECH组以及ZT+ECH组小鼠粪便，每组3只，由于水迷宫实验效果不佳，前期文献调查也发现肉苁蓉抗AD作用主要药效物质为苯乙醇苷[2,3]，因此我们仅选取SAMR1 组、SAMP8 组、ECH 组以及ZT+ECH 组小鼠粪便，采用Qiagen DNA 提取试剂盒提取DNA，提取后送至诺禾致源公司进行Illumina HiSeq2500 高通量测序，得到的原始图像数据文件，经碱基识别分析转化为原始测序序列（Sequenced Reads），其中包含测序序列（Reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息。通过对Reads 拼接过滤，OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类，并进行物种注释及丰度分析；进一步进行α多样性分析（αDiversity）、β多样性分析（βDiversity）和显著物种差异分析等。

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，结果均以平均值±标准差（x±S）表示。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 说明有显著性差异，P＜0.01说明有非常显著性差异。

2 结果与分析

2.1 对生存率的影响

SAM 鼠是研究衰老相关学习记忆障碍机制和药物筛选的理想动物模型。SAMP8鼠在渡过约4-6月龄的正常生长期后，迅速出现老化特征，往往伴随有学习记忆能力障碍、毛发脱落、免疫系统缺陷、昼夜节律异常、脑萎缩、神经元丢失及β淀粉样蛋白沉积等病理特征[6]。本实验中8.5 月龄SAMP8 小鼠喂养过程中伴有毛发脱落、皮肤和生殖器溃烂、脊柱后凸等特征，各组小鼠出现陆续死亡现象。给药31 d后，SAMR1小鼠生存率为80%（小鼠喂养过程中偶有打架现象，导致1只小鼠死亡；水迷宫期间将小鼠从SPF级动物房中拿出，出现1 只小鼠死亡），SAMP8 模型组、ECH 组、ZT 组以及ECH+ZT 组小鼠生存率分别为67%、64%、71%以及85%。模型组、ZT组和ECH组小鼠均出现生殖器溃烂至死亡现象，但ECH+ZT组未出现生殖器溃烂的现象，且小鼠活泼好动。与模型组相比，肉苁蓉多糖和联合给药均能延长SAMP8小鼠生存率，改善小鼠的生存质量（图1）。

2.2 对体重及脏器指数的影响

与SAMR1正常组小鼠相比，SAMP8模型组小鼠体重降低（图2），但是无统计学意义（P＞0.05）；与模型组小鼠相比，给药组小鼠体重略有升高，但也无统计学差异（P＞0.05）。与SAMR1组小鼠相比，SAMP8小鼠胸腺指数和脾脏指数均无显著性变化（图3）；与SAMP8小鼠相比，给药组小鼠也无明显的改善，但多糖组胸腺指数和脾脏指数有所提高，提示肉苁蓉多糖可能对SAMP8小鼠有免疫增强作用。

2.3 对行为学的影响

对每天2 次训练结果进行统计，实验结果用每组小鼠平均潜伏时间±SD表示。在Morris 水迷宫定位航行实验中，SAMR1组小鼠潜伏期呈下降趋势。自第2 d起，与正常组比较，模型组小鼠潜伏期明显长于正常组；随着训练天数的延长，ZT、ECH 及ZT+ECH 组与模型组比较潜伏期时间并没有明显缩短（图4）。在Morris水迷宫空间探索实验中，与SAMR1 组比较，模型组穿越平台次数和进入有效区域次数减少；与模型组相比较，给药组小鼠穿越平台次数无增加（表1）。虽然ZT组进入有效区域次数增多，但在水中表现为懒惰、偏爱漂浮在一个位置不动的现象。

2.4 对肠道微生物的影响

2.4.1 对物种丰度的影响

图1 SAMP8小鼠生存曲线

图2 肉苁蓉提取物对SAMP8小鼠体重的影响

图3 肉苁蓉提取物对SAMP8小鼠脏器指数的影响

图4 Morris水迷宫逃避潜伏期时间

表1 各组小鼠空间探索实验结果

16S 测序原始数据经过拼接、过滤、去嵌合体，得到优化的序列，使用QIIME 软件进行OUT 聚类分析，利用Silva 数据库进行注释，获得各样本在门、纲、目、科、属、种分类水平上的组成和丰度。结果显示，拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门在各组小鼠肠道菌群群落结构中占有绝对优势，SAMR1组：拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门的相对丰度分别为47.4%、39.5%、8.6%；SAMP8 组：三者相对丰度分别为48.9%、42.0%、5.0%；ECH 组：三者相对丰度分别为59.3%、27.3%、9.6%；ZT+ECH 组：三者相对丰度分别为61.0%、28.4%、6.9%。在门水平上，与SAMR1 组相比，SAMP8 组小鼠厚壁菌门丰度升高，变形菌门丰度降低，而ECH 及ECH+ZT均能增加拟杆菌门、变形菌门丰度，降低厚壁菌门丰度；在属水平上，各组中丰度较高的为拟杆菌属细菌（Bacteroides）、理研菌属（Alistipes）和毛螺菌属（Lachnospiraceae_NK4A136_group）（图5），与SAMP8模型组小鼠相比，ECH 及ECH+ZT 组bacteroides、理研菌（Rikenellaceae_RC9_gut_group）丰度上升，Lachnospiraceae_NK4A136_group和Alistipes丰度下降。

图5 物种相对丰度柱形图

与SAMR1小鼠相比，SAMP8小鼠虽然主要的肠道菌群丰度并未发生显著的改变，在门水平上，SAMP8组小鼠厚壁菌门丰度升高，变形菌门丰度降低，而ECH及ECH+ZT拟杆菌门、变形菌门丰度增加，厚壁菌门丰度降低，但无统计学意义；而丰度较低的绿菌门（Chlorobi）、浮霉菌门（Planctomycetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、TM6 门、衣原体门（Chlamydiae）、螺旋体门（Spirochaetes）、绿湾菌门（Chloroflexi）显著性上调（P＜0.05，t-test），疣微菌门（Verrucomicrobia）显著性下调（P＜0.05，t-test），此外有7 个纲、14 个目、29 个科、31个属、16个种的细菌丰度也发生显著改变。

ECH 虽然对高丰度的SAMP8 小鼠肠道菌群无明显调节作用，但能显著升高模型组低丰度绿菌门细菌，降低TM6 门细菌；ECH 和ZT 联合给药组对模型组小鼠低丰度肠道菌群的逆转作用更明显，具体表现在门水平上显著降低浮霉菌门、酸杆菌门、TM6 门、螺旋体门等丰度，显著升高Parcubacteria、疣微菌门等细菌丰度（P＜0.05，t-test）。

2.4.2 对物种多样性的影响

采用α和β多样性分析菌群的整体结构。α多样性反映的是单个样品物种丰度及物种多样性，有多种衡量指标：Chao1、ACE、Shannon、Simpson 等。Chao1 和ACE指数衡量物种丰度即物种数量的多少，Shannon和Simpson 指数用于衡量物种多样性。SAMP8 小鼠物种多样性最高（表2）。ECH 和ECH+多糖组均未能改善Observed species、Shannon、Chao1 和ACE 指数，说明ECH和联合给药组未能提高SAMP8小鼠肠道菌群α多样性，原因可能跟样本量少，个体差异大有关。

表2 α多样性指数统计表

β多样性分析主要是利用各样本的物种组成及丰富信息来反映样本间关系。如果样品的群落组成越相似，则它们在主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和主坐标分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）图中的距离越接近，反之，差异越大，距离越远。PCA 图中，模型组和ECH 组没有明显分开，提示ECH 对模型组小鼠肠道菌群多样性影响不明显（图6a）。基于Unweighted Unifrac 距离进行PCoA 分析（图6b），并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图展示，结果同样显示ECH+ZT 联合给药组菌群多样性和SAMR1组相近，而SAMP8组和ECH组较相近，说明联合给药组改善肠道菌群效果优于松果菊苷单独用药。PCA 及PCoA 分析均提示，SAMP8 与SAMR1 小鼠肠道菌群差距较大，而联合给药组可较大程度的逆转肠道菌群的改变。

图6 a PCA分析图

图6 b 基于Unweighted Unifrac 距离PCoA分析图

3 讨论

文献报道，肉苁蓉70%乙醇提取物有增加8 月龄SAMP8快速衰老小鼠的外周血和脾初始T细胞和自然杀伤细胞、降低促炎因子、延长生命周期的作用[7]。苯乙醇苷提高突触可塑性，改善SAMP8 小鼠认知，其对脑损伤的保护机制与可能与其增强自由基清除酶活性，减轻脂质过氧化反应相关[8,9]。多糖大多数不能被人体消化，但是能被肠道菌群中的多种酶降解为更小分子的寡糖和单糖发挥作用，且能扶植肠道益生菌的生长[10]。文献报道，通过肠道微生物介导，多糖与小分子化合物联用有增效的作用，如人参多糖促进人参皂苷的体内转化[11]、党参水煎液中共存的多糖促进皂苷的吸收[12]。Morris 水迷宫是AD 研究中评价动物学习记忆的经典方法。潜伏期、寻求次数反映小鼠学习、记忆能力，其值越短，说明小鼠学习、记忆能力越强。本实验肉苁蓉多糖和松果菊苷单用或是联合使用对8.5月龄SAMP8小鼠学习记忆行为学无改善作用，提示肉苁蓉多糖和松果菊苷对SAMP8小鼠的抗AD作用可能具有年龄依赖性[13]。ZT及ECH+ZT组小鼠生存率明显提高，特别是联合给药组未发生生殖器溃烂的现象，小鼠的精神状态和身体状态都有改善，提示多糖可能具有增强免疫的作用。

肠道的微生物以相对恒定的比例长期生活在肠道内。菌群的动态平衡与稳定在维持机体健康方面发挥重要作用。研究表明，肠道和大脑之间存在着脑-肠轴，肠道菌群的稳态与阿尔兹海默病、抑郁症等神经精神系统疾病相关[14]。随着年龄的增长，肠道有益菌比例逐渐降低。鉴于目前肉苁蓉对于SAMP8 小鼠肠道微生物的影响尚不清楚，我们在本研究中使用Illunima 高通量测序方法检测肉苁蓉组分对于小鼠的肠道微生物的调节作用。前期文献报道，SAMP8小鼠菌群失调与认知功能下降相关，在门、纲、目等水平上，共有27种细菌发生显著改变，其中26种细菌，包括脱铁杆菌门，显著降低，1 种显著升高。PCoA 分析也表明SAMP8 和SAMR1 小鼠肠道菌群显著不同[15]。本实验结果也同样提示SAMP8小鼠菌群结构发生变化，肉苁蓉多糖和松果菊苷联合给药可较大程度的逆转肠道菌群的改变，但是具体作用机制还有待进一步的研究。肉苁蓉作为补益类中药，在临床中有广泛的应用，本研究提示我们，肉苁蓉不同组分抗AD 活性可能具有时间依赖性，松果菊苷及松果菊苷和多糖联合应用具有调节肠道菌群的作用，该研究为肉苁蓉有效成分的开发利用提供科学依据，为治疗AD 疾病提供临床参考。