基于网络药理学预测西瓜皮营养成分防治糖尿病作用机制的研究＊

黄旭龙，郝俊杰，徐 锋，王祥培，吴红梅

（贵州中医药大学药学院 贵阳 550025）

西瓜皮又称西瓜翠衣，为葫芦科植物西瓜的外层果皮，性凉，味甘，无毒，入脾、胃二经，具有清热解暑，止渴，利小便之功效，用于防治暑热烦渴、小便短少、水肿、口舌生疮等[1]。我国作为西瓜生产大国之一，每年有约占西瓜总量1/3 的西瓜皮被随意丢弃，不仅造成环境污染，而且导致巨大的资源浪费，如何充分利用这些资源，将其变废为宝，开发出具有高附加值的产品，已经成为全社会关注的热点问题。目前，西瓜皮已广泛应用于食品、饮料、药物等领域[2-6]；现代研究表明，其含有丰富的营养与保健成分，主要包括果胶、维生素、蛋白质、矿物质、氨基酸，多糖等[7-11]，而这些成分具有防治高血压、肾炎、肝炎、糖尿病、黄疸等药理作用[12-16]。《现代实用中药》将其作为利尿剂，用于治疗糖尿病，肾脏炎浮肿，黄疸；《本草纲目》、《饮膳正要》均有记载，以西瓜皮煎汤代茶饮或西瓜皮、冬瓜皮、天花粉水煎用于防治消渴，而中医把糖尿病归属于消渴症的范畴[17]。但目前有关西瓜皮防治糖尿病的研究鲜有报道，而从细胞及分子水平进行系统全面的阐述西瓜皮防治糖尿病的作用机制未见报道。网络药理学整体性、系统性的特点，为揭示复杂药物作用机制提供新的思路和方法，与中药“多成分、多途径、多靶点”协同作用的特点不谋而合[18-23]。因此，本文采用网络药理学的方法，对西瓜皮活性营养成分中可能防治糖尿病的作用靶点以及信号通路进行分析，以期探讨西瓜皮防治糖尿病的分子机制，为西瓜皮资源的开发利用及深入研究提供参考。技术路线（图1）。

图1 基于网络药理学的西瓜皮营养成分防治糖尿病分子作用机制的技术路线

1 方法

1.1 数据的建立

通过查阅相关文献（CNKI、PubMed）及结合TCMSP 数据库、PubChem 数据库、TCMID 数据库等，以药效活性或ADME 参数（OB ≥30%和DL ≥0.15）为指标，筛选西瓜皮中所含的活性营养成分及结构，再运用BATMAN-TCM数据库，以Score cutoff（＞35）得分及Pvalue（P＜0.05）值等为指标，筛选西瓜皮活性营养成分对应的靶点。再依据相似性比较，通过中草药活性成分数据库（HIT，http：//lifecenter.sgst.cn/hit/）和治疗靶点数据库（TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）进行活性成分潜在靶点的筛选，建立活性成分潜在靶点数据集；并通过人类基因和基因表型综合数据库（OMIM，http：//www.omim.org/）筛选西瓜皮防治糖尿病的基因和蛋白靶点，建立糖尿病靶点数据集。人类的靶点连接蛋白通过交互蛋白数据库（http：//dip.doe-mbi.ucla.edu）获得。最后将筛选得到的所有靶点均经UniProt 数据库查询转化成UniProt ID格式。

1.2 网络构建与分析

为了阐明西瓜皮中活性营养成分与糖尿病靶点之间的关系，进行网络药理学相关分析。通过PPI（http：//www.genome.jp/kegg/）分析，将西瓜皮的营养成分、成分对应的靶点、糖尿病对应的靶点和交互蛋白对应的靶点连接成“成分-靶点-疾病”网络[24,25]。利用Cytoscape 3.6.1软件将以上网络进行可视化分析，得到每个节点的Degree、Betweenness centrality、Closeness centrality 三个拓扑参数通过CentiScaPe 1.2 进行评估，选择以上3个拓扑参数值满足分别大于所有点中位数值的靶点，作为西瓜皮防治糖尿病的目标靶点。

1.3 生物过程分析

利用STRING数据库（https：//string-db.org/）对所筛选出的靶点进行蛋白互作关系分析，最后对筛选的目标靶点使用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库进行KEGG 通路分析和GO（Gene Ontology）生物学过程分析。

1.4 构建西瓜皮防治糖尿病通路图

将西瓜皮与糖尿病相关联的目标靶点导入KEGG Pathway数据库，得到目标靶点在与糖尿病相关通路上的标注图，验证西瓜皮通过多靶点、多途径发挥防治糖尿病的作用。

2 结果

2.1 药物靶点和疾病靶点数据的筛选

通过查阅文献及结合PubChem数据库、TCMSP数据库，共得到8 个成分满足筛选条件（表1）。通过Cytoscape 软件筛选出602 个交互蛋白；通过网络药理学构建出西瓜皮防治糖尿病作用的交互网络，采用不同颜色和形状图形使其可视化后，可直观的看出营养成分与疾病靶点之间的网络关系（图2）。其中，黄色方形代表药物与疾病都作用的靶点，也是西瓜皮防治糖尿病最重要的靶点蛋白；黄色圆点代表糖尿病直接作用靶点；红色三角形代表西瓜皮中的被预测出的活性化合物；蓝色圆点代表西瓜皮营养成分的直接作用靶点；紫色圆点代表连接西瓜皮成分与疾病靶点的交互蛋白。

2.2 西瓜皮营养成分防治糖尿病直接作用靶点拓扑参数分析

通过对Cytoscape交互网络分析，得到西瓜皮活性营养成分相关联的蛋白靶点，并对这些蛋白靶标进行拓扑参数计算。以网络中所有点的（Degree、Betweenness centrality 和Closeness centrality）中位数均值作为计算结果，得到三个拓扑参数分别为：4、0.01和0.174。选择靶点中每个靶点的三个拓扑参数值均大于中位数均值的靶点作为西瓜皮防治糖尿病的重要靶点蛋白，最终筛选出22 个靶点满足以上条件（表2）。筛选出靶点的蛋白互作关系（图3），蛋白相互作用关系说明筛选出西瓜皮活性营养成分对防治糖尿病的作用蛋白相互关联和彼此调节。

表1 西瓜皮活性营养成分结构及靶标数

2.3 GO生物学功能分析

为了阐明西瓜皮防治糖尿病作用的分子机制，对其差异基因进行了GO生物过程富集分析。将22个潜在靶点映射到DAVID 数据库中，进行生物学功能富集，系统的分析其生物过程。共富集到156 条生物过程，其中P值≤0.01 的生物过程共有54 条（图4，表3）。结果表明，这些靶点与多种生物过程相关，主要包括RNA 聚合酶Ⅱ启动子对转录的正调控、信号转导、凋亡过程的负调控、昼夜节律、细胞缺氧反应、转录因子NF-kappaB 活性的负调控等生物过程进行调控，且这些生物过程与糖尿病的发生、发展密切相关，也反映了糖尿病发病机制涉及体内多个生物过程的异常，同时也表明西瓜皮可能是通过调节这些生物过程发挥防治糖尿病作用。

2.4 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组百科全书）通路分析

图2 西瓜皮活性营养成分防治糖尿病作用的“成分-靶点-疾病”交互网络

表2 西瓜皮营养成分防治糖尿病的直接作用靶点相关拓扑参数

图3 西瓜皮营养成分对防治糖尿病的蛋白靶标互作关系图

图4 西瓜皮防治糖尿病作用的GO生物学功能富集分析部分结果图

通过KEGG通路富集分析，筛选出31（P＜0.01）条通路与西瓜皮防治糖尿病的作用相关，其主要通路结果（图5，表4）。其中Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、Chronic myeloid leukemia、Hepatitis B 等通路都显示出具有直接或间接参与防治糖尿病的作用，此结果与糖尿病发病机制紧密相关。西瓜皮营养成分对Pathways in cancer信号通路作用靶点标注图（图6）。

3 讨论

糖尿病的发病机制比较复杂，目前已经明确的是与遗传、糖代谢紊乱、血流动力学改变、血小板活化致肾小球微循环障碍、氧化应激、炎症反应等多种因素有关[26-29]。西瓜皮中含有丰富的营养成分，具有较高的食用价值和药用价值，且其资源量大，药用历史悠久，而西瓜皮中所含的营养成分瓜氨酸具有提高免疫系统功能、维护关节运动、平衡正常的血糖水平的作用，其多糖也表现出一定的降糖作用[9,16]。因此，借助网络药理学从细胞及分子水平系统全面的阐述其以何种生物途径发挥防治糖尿病的作用机制显得极为重要。

表3 西瓜皮防治糖尿病作用的GO生物学功能富集分析结果

续表3

表4 西瓜皮防治糖尿病作用的KEGG 通路富集分析结果

图5 西瓜皮防治糖尿病作用的靶点KEGG 通路富集分析部分结果图

图6 西瓜皮营养成分在糖尿病相关通路中的作用靶点标注图

本研究基于网络药理学的方法，将预测得到的22个目标靶点导入KEGG Pathway数据库，得到目标靶点在Pathways in cancer 信号通路上的相关调控过程，结果显示胱天蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）、表皮生长因子受体（pidermal growth factor receptor，IKKE）、诱导型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase,inducible，iNOS）、细胞肿瘤抗原p53（p53 Cellular tumor antigen，p53）、雌激素受体（Estrogen receptor，ER）、肿瘤坏死因子受体超家族成员6（Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6，FAS）、转录因子E2F1（Transcription factor E2F1，E2F1）等靶点蛋白参与糖尿病的防治作用。Hai-Tao[30]等研究已证实人参皂苷Rg1 可降低糖尿病大鼠凋亡蛋白CASP3的表达，从而达到防治糖尿病的作用；于爱忠[31]等研究表明熊果酸能够增加胰岛素敏感性，抑制HIF-1α、核因子kappa-B激酶亚基β的抑制剂（Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta，IKKβ）、人核因子κB 抑制蛋白α（nuclear factor kappa B inhibitory protein alpha，IKBα）、核因子-k 基因结合（nuclear factor-k-gene binding，NF-kB）等炎症因子的表达，而发挥预防糖尿病小鼠视网膜病变；王丹妮[32]研究发现雷公藤甲素能降低糖尿病肾病大鼠肾组织中iNOS 与环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2 的表达水平，达到预防和保护肾脏的作用。张新爽[33]研究证实苯那普利能通过抑制Fas和Fas L的表达，达到防治糖尿病肾脏的损伤。虽然已有文献证明这些目标靶点具有防治糖尿病及并发症的作用，但目前有关西瓜皮抗糖尿病作用机制的研究尚未涉及到这几个靶点，因此，课题组下一步将深入研究这些目标靶点如何发挥抗糖尿病的作用。

本文采用网络药理学的方法对西瓜皮活性营养成分防治糖尿病的作用进行靶点和通路预测，筛选出西瓜皮8 个活性营养成分与疾病共同的直接作用靶点，并构建了“成分-靶点-疾病”交互网络图。通过通路富集分析，发现了31条通路和54个生物过程直接或间接参与防治糖尿病的作用。主要信号通路包括Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer、Chronic myeloid leukemia、Hepatitis B 等，主要生物过程包括RNA 聚合酶Ⅱ启动子对转录的正调控、信号转导、凋亡过程的负调控、昼夜节律、细胞缺氧反应、转录因子NF-kappaB 活性的负调控等，最终达到多成分、多靶点、多途径防治糖尿病的生物学效应。预测结果提示了西瓜皮活性营养成分防治糖尿病与Pathways in cancer 等信号通路密切相关，课题组下一步将拟选取这几条通路进行动物实验验证，旨在为西瓜皮资源的开发利用及深入研究提供参考。