泗阳县草鱼养殖细菌性病原嗜水气单胞菌分离、鉴定和药敏试验

李晓丽 冯 龙 陈 瑜 李 勇

草鱼作为泗阳县传统的优良淡水养殖品种，一直深受广大渔农的欢迎。但是近年来随着水产集约化养殖的发展，草鱼的养殖放养密度越来越大，人工配合饲料投喂量也越来越多，导致养殖水体的水质日益恶化。加上渔农防病治病的意识落后，受价格影响的存塘量和环境因素的变化，导致草鱼多种细菌性疾病如烂鳃病、赤皮病和肠炎病等愈加严重，甚至极少数养殖户草鱼养殖全军覆没，损失惨重，严重打击了养殖户的积极性。

经过近三年对泗阳县水产养殖细菌性疾病的研究发现，由嗜水气单胞菌引起的草鱼疾病将近占细菌性疾病的50%。因此，2018年泗阳县水生动物疫病防控中心对县域内草鱼养殖进行了疫病监测，并对具有代表性特征的病草鱼进行了病菌株分离和鉴定，将鉴定出的嗜水气单胞菌进行了常用抗生素药物敏感性实验，旨在为嗜水气单胞菌病原引起的草鱼细菌性疾病有效检验与防控及相对应的有效治疗提供依据，防止药物的滥用和误用，避免病情的耽误而带来不必要的经济损失。

一、材料与方法

1.实验材料

（1）2018年5-10月在全县的主要草鱼养殖场的不同发病塘口，选取具有典型特征的病草鱼进行分离，分离部位为血液，具体的采样时间、地点、症状、菌株种类详细情况见表1。

表1 菌株分离清单汇总表

（2）营养肉汤、营养琼脂、TCBS琼脂、脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂购于北京路桥。氧化酶试剂盒购于杭州微生物试剂有限公司，肠杆菌和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒（比色法）（英文名API 20E）购于梅里埃诊断产品（上海）有限公司，动物用药敏分析试剂板购于南京菲恩医疗科技有限公司。

2.实验方法

（1）细菌的分离纯化。样品先用酒精棉擦拭，用灭菌的注射器抽取血液放于营养汤，置于28℃恒温培养箱中培养18～24小时。在无菌条件下，用灭菌的接种环取培养液划线接种于普通营养琼脂培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养18～24小时。观察菌落形态，并挑取可疑单个菌落划线接种脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂培养基上，置于28℃恒温培养18～24小时。

（2）API试剂条微生物鉴定。用灭菌吸管挑取单个菌落至0.85%的NaCl中制成菌液，将5mL无菌水放进培养盒里，将试剂条放进培养盒内，将菌液接种到小管或者小管及小杯（CIT，VP和GEL），利用矿物油覆盖制定的生化孔（有划线的孔）ADH、ODC、H2S和URE。盖上培养盒，于35～37℃孵育18～24小时，同时做氧化酶实验构成第21个实验。孵育后根据判读表判断各反应结果，参照生化谱手册，得到鉴定结果，同时参照NCCLs和CLSI标准对药物的敏感性及耐药性进行判断。

（3）病原菌的药敏实验。本实验分别对12株致病性嗜水气单胞菌进行了抗菌素感受性实验。实验步骤如下：挑取纯化后的单个菌落于5mL生理盐水中，制成0.5麦氏单位浓度的菌悬液制成A管；取2支10mL的无菌生理盐水，打开任意一瓶，以无菌的方式向阴性对照孔分别加入200μL的无菌生理盐水；从A管中吸取200μL菌悬液加入到打开的10mL无菌生理盐水中制成B管。将B管所有菌液倒入到经灭菌的V形槽中，再将另一支10mL无菌生理盐水倒入V形槽中。混均后，利用微量移液器吸取V形槽中的菌液加入到所有微孔中（阴性对照除外）200μL；将加样好的药敏分析试剂板放入28℃的恒温培养箱中培养24～28小时，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，孔内液体浑浊为阳性（+），孔内液体澄清为阴性（-），最低药物浓度即药物的最小抑菌浓度（MIC）。

二、实验结果

1. 嗜水气单胞菌分离及形态特征观察

从病鱼血液分离到的嗜水气单胞菌在基础营养琼脂上为光滑、湿润、微凸、无色菌落，在脱脂奶蔗糖胰蛋白胨琼脂平板上，菌落呈乳白色、微凸、湿润，周围出现清晰的透明圈。

2. 嗜水气单胞菌的氧化酶试验和生理生化鉴定

对分离的细菌进行生理生化检测，结果判定为嗜水气单胞菌的具体生理生化特征见表2。对分离到的嗜水气单胞菌进行Ⅰ和Ⅱ分类，并分别命名为Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅰ-3和Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅱ-6、Ⅱ-7、Ⅱ-8、Ⅱ-9。

表2 鉴定试剂条检测结果

3.嗜水气单胞菌的药敏试验结果

12株嗜水气单胞菌对8种抗菌药物的最小抑制浓度（MIC）如表3所示。12株嗜水气单胞菌对抗菌药物的感受性如表4所示。

表4 12株嗜水气单胞菌对抗菌药物的感受性

三、讨论与分析

试验分离到的嗜水气单胞菌分离株，对8种抗菌药物进行的药敏试验，对草鱼选用抗生素具有一定的指导价值。药敏试验结果表明，12株嗜水气单胞菌对检测的8种抗菌药物的敏感性基本一致。嗜水气单胞菌对恩诺沙星、硫酸新霉素和乳酸环丙沙星敏感性最高，敏感菌株率达100%，其次对氟苯尼考，敏感率为91.67%。但对红霉素最不敏感，耐药菌株率达100%，其次是甲砜霉素，耐药菌株率达83.33%。因此，建议在本区域内对嗜水气单胞菌引发的疫病首选恩诺沙星、硫酸新霉素、乳酸环丙沙星和氟苯尼考。

在水产养殖用药过程中，合理地选择抗菌药物的种类和适宜的使用浓度，对建立正确的合理用药机制具有实际意义。从泗阳县草鱼的病样分离的嗜水气单胞菌分离株对大多数抗生素类药物表现出较高的敏感性，这与泗阳县草鱼养殖过程中使用较少的抗生素有关。

（通联：223700，江苏省泗阳县水产技术指导站 电话：17805228015）

表3 12株细菌对8种抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）对照表